miRNAs介导的BDNF调节猪卵泡颗粒细胞增殖的机制

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a member of neurotrophins, which is required for nervous cell survival. Recent evidences have shown that BDNF plays important roles in animal reproduction, for example, facilitating follicular development, oocyte maturation, zygote development. Our laboratory firstly reported the expression of BDNF in porcine reproductive tissues and BDNF secreted by follicular granulosa cells could promote proliferation of follicular granulosa cells. Furthermore, BDNF could regulate oocyte maturation through downregulating miRNA-205. However, there is not any evidence on the regulation of BDNF in follicular granulosa cells. Techniques of miRNA-sequencing, cell transfection, CRISPR/Cas9, etc., will be used to study the regulatory mechanism of BDNF on proliferation of granulosa cells through miRNAs pathway. The project will provide new theoretical evidences for the role of BDNF in the development of ovarian follicle, and further provide potentially new ways for improvement of follicular development.

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养素家族成员之一，其主要作用是调节神经细胞功能。近年来国内外文献报道了BDNF在动物繁殖过程中的某些作用，如促进卵泡发育、卵母细胞成熟、受精卵发育等。本课题组曾首次研究了BDNF及其受体TrkB在母猪生殖系统中的表达规律，发现卵泡颗粒细胞能分泌BDNF，并且BDNF能促进卵泡颗粒细胞增殖。进一步研究表明，BDNF可通过调节颗粒细胞中miRNA-205来促进猪卵母细胞成熟。然而，BDNF调节猪卵泡颗粒细胞增殖的机制尚不清楚。因此，本项目通过miRNAs高通量测序、细胞转染、CRISPR/Cas9等技术，从miRNAs角度，研究BDNF在猪卵泡颗粒细胞增殖中的作用机制，为阐明BDNF在母猪卵泡发育中的作用机理提供理论依据，期望为提高母猪卵泡发育效率提供新的调节途径。

BDNF是神经营养素家族成员之一，参与调节动物的繁殖生理，但机制尚不清楚，本项目通过miRNAs高通量测序、细胞转染等技术，从miRNAs角度，研究BDNF在猪卵泡颗粒细胞增殖中的作用机制。具体结果如下：.1.BDNF促进猪卵泡颗粒细胞的增殖.在猪卵泡颗粒细胞中添加BDNF、BDNF受体抑制剂以及转染BDNF siRNA，结果发现，BDNF能够促进Bcl2、CCND1等增殖和细胞周期相关基因mRNA的表达，抑制Bax等细胞凋亡基因mRNA的表达，同时对猪卵泡颗粒细胞活力和细胞周期存在调控作用。说明BDNF能够促进猪卵泡颗粒细胞增殖。.2.Dicer1介导BDNF对猪卵泡颗粒细胞增殖的调节.在猪卵泡颗粒细胞中转染Dicer1 siRNA后，用BDNF处理细胞，发现，BDNF对细胞的增殖作用减弱。.3.BDNF调节猪卵泡颗粒细胞中miRNAs的表达模式.BDNF处理颗粒细胞后，发现细胞中的MicroRNAs出现显著差异，有72条MicroRNAs的表达发生改变，其中上调34条，下调38条。.4.BDNF通过调节miRNA-127促进颗粒细胞增殖.BDNF能抑制猪卵泡颗粒细胞中miR-127的表达。miR-127通过靶向CCND1调节颗粒细胞增殖。同时发现，miR-127能够激活MAPK-ERK信号通路，上调CDK6进而促进细胞增殖。.5.BDNF通过调节miRNA-205表达促进卵母细胞成熟.BDNF处理猪COCs显著下调了miRNA-205表达水平，显著上调了其靶基因PTX3和卵丘扩散标记基因HAS2和TNFAIP6表达水平。进一步验证发现，BDNF通过miRNA-205-PTX3通路调节卵母细胞成熟。.6.猪卵泡液外泌体调控卵泡颗粒细胞功能.发现猪卵泡液外泌体中存在丰富的外泌体，其通过激活颗粒细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK通路调节颗粒细胞增殖和类固醇激素的合成。.以上结果为进一步阐明猪卵泡发育分子机制提供了新的理论证据，为繁殖新技术的研发开辟了新途径。.