EGFR介导MAPK/ERK信号通路调控鹌鹑卵泡颗粒细胞增殖分化的分子机制

Follicular development is closely related to the laying performance of quail, and it is directly affects the quail egg production and breeding benefit, is the symbol of follicular development. Proliferation and differentiation of granular cells are important for follicular development, but the specific mechanism of granular cells on the development of the poultry follicle is still unclear. The previous experimental result of the applicant and reports shows that EGFR play important roles in follicular development. The aim of this study is to construct regulation network of EGFR gene and its transcription factor GATA-4 in proliferation and differentiation of quail granular cells. First,The follicular granule cells are dissected from ovary of adult quails and primary cultured. On the basis of establishing the quail follicular granular cell, we will study the effect of EGFR on proliferation, differentiation and hormone levels of quail follicular granular cells. And then, at molecular and cellular levels, we will study the transcriptional regulation of GATA-4 to EGFR, the target relationship between GATA-4 and EGFR gene and the regulation of MAPK/ERK signaling pathway in proliferation and differentiation of granular cells. Eventually, we will parse the EGFR mediated MAPK/ERK signaling pathway regulate proliferation and differentiation of quail granular cells. Clarify this scientific problem will be providing theoretical basis and new ideas for quail breeding and laying production.

卵泡发育与鹌鹑的产蛋性能密切相关，直接影响鹌鹑蛋的产量和鹌鹑的养殖效益。颗粒细胞的增殖分化在卵泡发育过程中发挥至关重要的作用，是卵泡发育的标志，但其对家禽卵泡发育的作用机制尚不甚明确。申请者前期研究结果和文献报道显示，EGFR基因在卵巢及卵泡发育过程中发挥重要的调控作用，本研究旨在构建EGFR及其转录因子GATA-4在鹌鹑卵泡颗粒细胞增殖分化中的表达调控网络。首先分离培养卵泡颗粒细胞的原代细胞，并在此基础上分析EGFR对颗粒细胞增殖分化、激素水平的影响；其次从分子和细胞水平研究转录因子GATA-4的对EGFR的转录调控作用、EGFR与GATA-4及由此介导的MAPK/ERK信号通路在颗粒细胞增殖分化中的调控作用；最终解析EGFR介导MAPK/ERK信号通路调控鹌鹑卵泡颗粒细胞增殖分化的分子机制，为鹌鹑育种与生产提供理论依据和新思路。

卵泡发育与鹌鹑的产蛋性能密切相关，直接影响鹌鹑蛋的产量和鹌鹑的养殖效益。颗粒细胞的增殖分化在卵泡发育过程中发挥至关重要的作用，是卵泡发育的标志，但其对家禽卵泡发育的作用机制尚不甚明确。申请人前期研究结果和文献报道显示，EGFR基因在卵巢及卵泡发育过程中发挥重要的调控作用，本研究旨在构建EGFR及其转录因子E2F4在鹌鹑卵泡颗粒细胞增殖分化中的表达调控网络。具体研究内容包括：（1）分析EGFR和E2F4的表达定位情况；（2）分析EGFR对颗粒细胞增殖分化及激素水平的影响；（3）E2F4与EGFR转录调控关系鉴定；（4）E2F4/EGFR通过MAPK/ERK信号通路调控鹌鹑卵泡颗粒细胞增殖分化的机制研究。经过三年的执行，本项目通过克隆EGFR基因，分析其时空表达特征，并对其调控功能进行研究，取得如下结果：（1）EGFR基因在鹌鹑白卵泡组织中的表达量显著高于黄卵泡组织，且定位于卵泡膜中；通过细胞周期分析、荧光定量、Western-blot等方法分析发现EGFR基因促进了鹌鹑卵泡颗粒细胞的增殖。（2）确定了EGFR基因的核心启动子区域，利用CHIP、双荧光素酶检测法验证发现该启动子区存在转录因子E2F4的结合位点；进一步分析发现E2F4可以上调EGFR基因的启动子活性，且过表达E2F4后EGFR基因的表达量显著升高，说明转录因子E2F4对EGFR基因的表达具有上调作用。（3）在鹌鹑卵泡颗粒细胞中，过表达EGFR基因后，MAPK/ERK信号通路的关键基因HRAS、Raf1、MEK2及其下游基因c-myc的表达量极显著升高，说明EGFR基因对MAPK/ERK信号通路具有促进作用；添加MAPK/ERK信号通路抑制剂后，EGFR基因对该通路下游基因的影响消失。综上，EGFR基因对鹌鹑的卵泡颗粒细胞增殖具有促进作用，其调控机制主要是转录因子E2F4通过与EGFR基因核心启动子结合，并通过MAPK/ERK信号通路促进了鹌鹑卵泡颗粒细胞的增殖。