SVZ神经前体细胞对缺血性脑卒中保护作用的实验证实及环境星形胶质细胞的增强作用

如何构建一种安全、高效的能维持移植细胞存活、促进其增殖、分化及功能成熟的治疗方案是改善当前细胞在体移植治疗缺血性脑卒中效果有限的瓶颈与难点。本项目基于神经前体细胞在体内、体外均能分化为各表型神经细胞，及环境星形胶质细胞能分泌促神经再生因子的理论基础上，针对脑卒中后大量神经元死亡、突触丧失而目前药物治疗无法挽救的困境，利用神经前体细胞的分化潜能和星形胶质细胞的调节作用，采用立体定位注射技术将SVZ神经前体细胞或与环境星形胶质细胞的共移植物输送到卒中大鼠的缺血半暗带区，利用免疫组织化学、免疫荧光双标、免疫电镜、膜片钳等技术，观察神经前体细胞的发育分化、功能蛋白表达、电生理活动及与宿主细胞的突触重建。研究可解决移植细胞在缺血脑存活率不高、治疗效果差的关键技术问题，证实环境星形胶质细胞具有加强神经前体细胞治疗的能力，为今后缺血性脑卒中的治疗提供新的思路和实验证据。

以往研究证实环境星形胶质细胞可通过旁分泌促进神经干细胞向神经元方向分化。在本项目中我们以短暂性缺血性脑卒中大鼠为模型，于手术后48h将EGFP-标记的神经干细胞联合环境星形胶质细胞移植到缺血性脑卒中大鼠纹状体内，并以神经干细胞单独移植作为对照，研究细胞移植后不同时间点神经干细胞在缺血性脑卒中大鼠脑内的存活、增殖和分化。实验结果表明，与神经干细胞单独移植相比，神经干细胞联合环境星形胶质细胞移植能更有效地促进神经干细胞的存活、增殖和向功能性神经元分化且未发现胶质瘤。结果提示环境星形胶质细胞可提高移植的神经干细胞改善缺血性脑卒中的效率，为神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中提供了新实验依据。.颗粒蛋白（PGRN）是主要表达于胶质细胞和神经元的一种神经营养因子，研究证实其具有调控神经突起的生长和促进神经元分化的能力。在本项目中我们还检测了PGRN在神经干细胞及其亚细胞群的表达变化，以探讨其在脑卒中及神经退行性疾病的发病机制和潜在的生物学效应。为了研究神经干细胞及其分化细胞中PGRN的表达，我们用SVZ来源的神经干细胞，采用细胞免疫荧光双标法检测了PGRN在神经元及其分化细胞中的表达，并采用组织免疫荧光双标法检测了PGRN在新生鼠脑内的表达及定位。结果表明PGRN可在神经干细胞及其分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞中大量表达。进一步的结果证实，PGRN主要在新生鼠脑神经元及小胶质细胞中表达，而较少在星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达，这些结果提示PGRN在神经干细胞分化过程中具有一定调控作用。我们进一步应用短暂性脑缺血-再灌注早期大鼠脑组织，检测了大鼠的额颞叶皮质、海马及纹状体中PGRN的表达变化。采用线栓法制备右侧大脑中动脉阻塞1h，然后再灌注0.5、2、12、24h SD大鼠短暂性脑缺血-再灌注模型，以假手术组为对照。用TTC染色法观察缺血梗死体积。用免疫荧光组织化学法和Western-Blot分别检测PGRN的细胞定位及其表达变化。结果表明短暂性脑缺血-再灌注后， PGRN在大鼠脑缺血区及半暗带区的表达水平显著提高，提示PGRN可能对缺血后脑损伤有保护和修复作用。