MT-I/II通过抑制氧化应激介导星形胶质细胞对缺血性神经损伤的保护作用研究

缺血应激条件下金属硫蛋白-I/II(MT-I/II)可能在星形胶质细胞介导的神经保护效应中发挥重要作用。本课题应用MT-I/II敲除(MT-/-)和野生型(MT+/+)小鼠，建立来源于这两小鼠的星形胶质细胞、神经元以及这两种细胞的共培养模型。体内试验观察MT-I/II存在/缺失条件下脑缺血应激诱导的神经损伤和MT-I/II表达情况，确证MT-I/II的神经保护作用；观察体外模拟缺血应激(OGD/Rep)引起的星形胶质细胞和神经元损伤，检测OGD/Rep对星形胶质细胞MT-I/II表达和分泌的影响，明确外源性MT-I/II对神经元损伤的作用；比较MT+/+和MT-/-星形胶质细胞对OGD/Rep诱导的氧化应激的敏感性，探索MT-I/II抗缺血性神经损伤的作用靶标与机制。为阐明MT-I/II在介导星形胶质细胞抗缺血性神经损伤中的作用及其机制，开发MT-I/II的实际应用价值提供理论和实验依据。

金属硫蛋白（MTs）是一类富含半胱氨酸残基的金属连接蛋白，MT-I和II（MT-I/II）是中枢神经系统中MT的主要异构形式。近年来研究表明，MT-I/II具有抗脑缺血损伤和神经保护作用，但其在脑缺血损伤过程中的具体作用靶位与机制均不清楚。本项目应用MT-I/II基因敲除（MT-/-）小鼠和同源的野生型（MT+/+）小鼠，建立了原代培养的新生MT-/-和MT+/+小鼠星形胶质细胞以及星形胶质细胞与神经元细胞共培养模型。通过暂时性大脑中动脉阻塞（MCAO）手术，建立暂时性脑缺血再灌注模型，检测脑缺血应激对脑皮层组织MT-I/II表达的影响，比较MT-I/II存在/缺失条件下脑缺血再灌注损伤特征，并从氧化应激与线粒体生成功能调节角度探讨了MT抗脑缺血损伤的可能作用机制；同时采用细胞氧-糖剥夺培养再灌注（OGD/Rep）建立体外模拟缺血再灌注模型，观察OGD/Rep对星形胶质细胞以及星形胶质细胞与神经元共培养细胞的损伤作用。研究结果表明，脑缺血再灌注可显著诱导MT-I/II基因表达，同时上调MT-I/II的蛋白质表达水平；与MT+/+小鼠相比，MT-/-小鼠对脑缺血再灌注诱导的脑组织病理学改变、细胞凋亡、氧化损伤以及神经行为学改变等更为敏感；脑缺血再灌注激活线粒体生成功能而产生自主保护作用，MT缺失可显著抑制线粒体生成功能活化与线粒体抗氧化物表达上调，这可能与调节过氧化物增殖体激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）通路密切相关。体外实验结果证实，MT缺失可加剧OGD/Rep诱导的星形胶质细胞和神经元损伤；MT-/-星形胶质细胞对OGD/Rep引起的细胞氧化应激和线粒体膜电位下降更为敏感；白藜芦醇（Resv）可诱导星形胶质细胞MT-I/II的基因表达，抑制OGD/Rep引起的细胞损伤，但其保护作用在MT-/-细胞中明显减弱，提示MT诱导表达可能介导了Resv的抗OGD/Rep损伤作用。以上研究结果确证了MT-I/II对脑缺血再灌注损伤的保护作用，揭示星形胶质细胞MT-I/II对神经元的保护效应，阐明MT-I/II的抗脑缺血神经损伤作用与其抑制氧化应激、保护线粒体功能密切相关，提示PGC-1α介导的线粒体生成功能与抗氧化物表达调节在MT-I/II神经保护效应中具有重要作用，星形胶质细胞MT-I/II有可能成为预防和/或治疗脑缺血疾病的重要靶点。