MicroRNA-210对乏氧肿瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究

乏氧在实体瘤中普遍存在，提高乏氧肿瘤细胞的放射敏感性是提高放疗效果的重要途径。研究发现MicroRNA-210在乏氧条件下以依赖HIF-1α的方式特异高表达，并在乏氧肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、转移和DNA损伤修复等过程中起重要作用，可能是产生辐射抗性的重要因素。本研究拟将MicroRNA-210作为提高乏氧肿瘤细胞放射敏感性，增强放射治疗疗效的新靶点，构建其慢病毒过表达载体和反义表达载体，转染乏氧培养的肝细胞癌SMMC-7721细胞，探讨其过表达或低表达对乏氧肿瘤细胞放射敏感性的影响及其机制，并通过研究其表达水平对裸鼠体内移植瘤放疗效果的影响以验证MicroRNA-210分子靶向治疗提高实体瘤放疗疗效的可行性。

为探讨miR-210表达下调对乏氧人肝癌SMMC-7721细胞放射敏感性的影响，利用分子生物学技术构建miR-210反义和随机寡核苷酸慢病毒载体，经慢病毒转染建立稳定转染miR-210反义和随机寡核苷酸的人肝癌SMMC-7721细胞株。以实时定量RT-PCR检测乏氧SMMC-7721细胞HIF-1α mRNA表达和miR-210表达，以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果表明，SMMC-7721细胞乏氧培养后HIF-1α和miR-210表达随时间逐渐增加，稳定转染miR-210反义寡核苷酸能明显下调miR-210在乏氧细胞的表达；下调miR-210表达明显抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖活性，诱导G1期阻滞，促进细胞凋亡，提高乏氧SMMC-7721细胞放射敏感性，放射增敏比约为1.21。上述结果提示，下调miR-210表达可抑制乏氧SMMC-7721细胞体外增殖，诱导凋亡，增强其放射敏感性。为研究敲低miR-210联合放疗对裸鼠体内移植人肝癌细胞SMMC-7721的抑瘤效应，将稳定转染miR-210反义序列和随机序列的人肝癌细胞SMMC-7721接种于裸鼠。待各组裸鼠肿瘤直径达到6-8mm，检测各组裸鼠miR-210和相关蛋白表达；24 h后各组裸鼠肿瘤局部在常氧或乏氧条件下接受8 Gy 60Co γ射线照射，检测各组裸鼠放疗后不同时间的肿瘤体积；照后24 h用免疫组化染色检测肿瘤细胞增殖活性和肿瘤间质微血管密度，用TUNEL法检测肝癌细胞凋亡率。结果表明，miR-210敲低组的miR-210和乏氧诱导因子-1α表达明显低于对照组；miR-210靶基因蛋白表达明显高于对照组；照射后9-30天，miR-210敲低常氧或乏氧照射组的肿瘤体积分别明显小于随机序列常氧或乏氧照射组；照射后24 h，miR-210敲低常氧或乏氧照射组的肿瘤细胞增殖活跃度和肿瘤间质微血管密度分别明显低于随机序列常氧或乏氧照射组，细胞凋亡率则明显升高。上述结果提示，miR-210敲低可提高裸鼠移植人肝癌的放疗效果。