藤茶双氢杨梅树皮素协同β-内酰胺类抗生素抗MRSA生物被膜的作用机制研究

The resistance of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)is in critical condition which the mechanism involving β－lactamase and a new protein PBP2a. Currently, the formation of bacterial biofilm is considered as one of the multi-resistance mechanism. We have found that Ampelopsin(APS)which extracted from Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz) in Guangxi showed the synergistic effects against MRSA when combinating with β－lactam antibiotics in vitro and in vivo. We speculate that the drug may has intervention in the formation of MRSA biofilm.We are trying to survey the anti-biofilm effect from the variation of biofilm morphology and key genes with argentation, MTT, CLSM and Real time fluorescence quantitative RT-PCR in vitro. MRSA biofilm lung infection tree shrew model was established to evaluate the anti-infective effect on the bacterial number in lung, Pathological morphology and the levels of inflammatory cytokines. The project aims to clarify essentially the anti-biofilm mechanism of the combination of APS and β－lactam antibiotics, and to provide a basis for the rationality of APS combination with β－lactam antibiotics.

MRSA在临床的耐药情况日益严重，其耐药机制除了生成β-内酰胺酶和生成新的PBP2a外，目前生物被膜的形成被认为是其耐药尤其是多重耐药的机制之一。我们前期研究发现，广西藤茶提取物双氢杨梅树皮素（APS）与β－内酰胺类抗菌药物合用后可在体外、体内发挥协同抗MRSA作用。由此我们推测APS对MRSA生物被膜形成的环节可能具有一定干预作用。本课题拟以96孔板建立MRSA生物被膜体外模型，采用MTT法、激光共聚焦显微镜法及实时荧光定量RT-PCR等方法，从MRSA生物被膜形态变化、形成关键基因的表达水平等方面观察药物对MRSA生物被膜的作用；构建MRSA生物被膜肺部感染树鼩模型，从肺部定殖细菌数、病理学形态变化及炎症细胞因子变化水平等方面研究药物对MRSA生物被膜体内抗感染的作用，力图从本质上阐明APS协同β-内酰胺类抗菌药物抑制MRSA生物被膜、逆转MRSA的耐药机制，为其联合用药提供理论依据。

MRSA 在临床的耐药情况日益严重，其耐药机制除了生成β-内酰胺酶和生成新的PBP2a外，目前生物被膜的形成被认为是其耐药尤其是多重耐药的重要机制之一。本项目以目前临床耐药程度严重并产生物被膜的MRSA为受试菌，通过采用现代分子、细胞生物学方法深入研究广西藤茶提取物APS单用及与 β-内酰胺类抗生素联用对MRSA生物被膜的作用及其对MRSA生物被膜形成重要环节（初始黏附、细胞间积聚）中关键耐药基因调控的影响；以肺部MRSA生物被膜感染食蟹猴和小鼠模型、皮下感染成膜菌小鼠模型以及致死性和亚致死性菌血症小鼠模型研究APS单用及与β-内酰胺类抗生素联用的体内抗感染作用。结果表明，APS在低于MIC浓度以下单用能显著抑制MRSA生物被膜的产生，且与β-内酰胺类抗生素联合应用在体外具有协同抗MRSA效应，这些效应可能是通过对生物被膜形成三个阶段关键基因，如sarA、icaA、icaR、agrA和hla基因的表达调控来实现影响MRSA生物被膜的形成，达到协同效应；动物体内实验结果表明，在小鼠皮下埋植硅胶片法构建体内MRSA生物被膜模型中，APS灌胃给药联合青霉素注射给药也可明显抑制生物被膜的形成，减少血液中活菌数；在肺部感染MRSA小鼠模型中，APS灌胃给药联合头孢西丁注射给药也可显著减少肺内活菌数，减轻肺炎损伤的严重程度；在MRSA致小鼠致死性菌血症模型中，APS能显著提高小鼠存活率；在MRSA致小鼠亚致死性菌血症模型中，APS能显著减少血中活菌数，纠正血常规指标的异常，改善重要器官的肿大，尤其是肾脏和脾脏；以上动物实验中APS效应还与其影响IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ等细胞因子有关；在肺部感染MRSA食蟹猴模型中，APS单用及与青霉素联合用药可显著改善感染动物的肝、肾功能，降低血清酶活性等，从而达到协同治疗的效果。本项目完成了以上研究内容，阐明了APS与与β-内酰胺类抗生素联用对MRSA生物被膜的分子作用机制及免疫调节效应，为其临床联合用药提供重要的理论依据。