广西藤茶提取物APS对MRSA耐药信号通路MecR1和BlaR1影响的研究

本项目针对具有抗多发性、难治性、多重耐药性特点MRSA作用的广西藤茶提取物APS进行应用基础研究。我们前期研究表明APS体内外具有明显抗MRSA作用，能破坏MRSA细胞壁的完整性，明显抑制菌体TdR、UR生物合成。本项目拟采用头孢西丁纸片扩散法鉴定临床分离菌株，筛选出符合实验要求的MRSA菌株，采用常规抗菌药物药效学方法、试管棋盘稀释法以及RT-PCR、Westen-blot和酶学方法等先进、可靠的实验方法研究APS单用及与万古霉素或β-内酰胺类抗生素联用对MRSA的抗菌活性及其对与MRSA耐药性密切相关的MecR1和BlaR1信号通路中耐药基因mecR1、blaR1及其下游基因mecA、blaZ和PBP2a蛋白表达及β-内酰胺酶活性等的影响，力图从本质上阐明APS抗MRSA活性的作用环节及作用靶位，并评价其与万古霉素和β-内酰胺类抗生素联合用药的意义，为APS的合理开发利用提供科学依据。

本项目按原资助计划顺利完成。本经K-B纸片扩散法及mecA基因检测法鉴定，有4株菌株为符合要求的MRSA。肉汤二倍稀释法测得单用APS的MIC为125µg/mL。联合药敏实验结果显示，在与6种β-内酰胺类抗生素联合用药中，除与头孢吡肟合用表现为相加作用外，其余5种抗生素——青霉素、苯唑西林、头孢唑林、泰能、头孢西丁与APS合用均表现为协同抗菌作用。在体内抗菌实验中，APS与泰能或头孢西丁合用对腹腔MRSA感染小鼠的保护作用明显好于各个药物单用的效果；其中APS与泰能联合应用对MRSA腹腔感染小鼠的保护作用最强，表现出较强的协同作用； APS与头孢西丁合用后虽然对感染小鼠的保护率与单用APS相当，但比单用头孢西丁的ED50下降将近16.7倍。APS单用能显著减少肺部MRSA感染小鼠的肺部活菌数；高剂量的APS与泰能、头孢西丁合用后，其肺部活菌计数明显少于模型组。APS与泰能或头孢西丁合用能明显改善肺部炎症病理状态。在扫描/透射电镜下，经APS单用或与β-内酰胺类抗生素作用后的MRSA绝大多数菌体的细胞壁、细胞膜结构层次不清晰，胞壁出现溶解破损现象，细胞膜皱缩变形或破裂，菌体细胞明显膨大, 可见内容物溢出等现象。头孢硝噻吩水解法结果表明，他唑巴坦对β-内酰胺酶具有强的抑制作用。APS 无论单用或与泰能、头孢西丁合用对β-内酰胺酶的抑制作用都较弱，与空白未用药组比较，无显著性差异。分光光度法结果表明单用APS 和泰能能显著减少PBP2a含量，单用头孢西丁对MRSA PBP2a的表达无显著作用。而APS与两药联合应用时，对MRSA的PBP2a 表达具有明显抑制作用。PCR结果表明，APS与泰能、头孢西丁合用后，能明显减少mecA、femA、femB基因的mRNA 的表达；而不论APS单用或与泰能、头孢西丁联合用药后对blaZ的mRNA 的表达无明显影响。综上所述，APS与β-内酰胺类抗生素合用体内外均具有协同抗菌作用。通过破坏细菌细胞壁，减少PBP2a的表达，阻断mecR1-mecI-mecA信号通路中的mecA及耐药辅助基因femA、femB的mRNA表达，从而降低MRSA的耐药性，这可能是APS与β-内酰胺类抗生素合用逆转MRSA耐药性的作用机制。本项目目前已申报发明专利一项，发表中文核心文章2篇，培养博士、硕士研究生各一名，参加学术交流会1次。