柱花草苯丙氨酸解氨酶SgPAL1抗炭疽病的功能分析与调控机制研究

Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the most destructive fungal diseases of stylo (Stylosanthes spp.), which is an important tropical forage legume. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) is the first key enzyme and speed limiting enzyme in the secondary metabolite pathway of the phenylpropane. However, little information about the function of PAL in plant defense against pathogen is available. In our previous study, the expression of SgPAL1 was increased by C. gloeosporioides treatment in stylo leaves. Overexpression of SgPAL1 in Agrobacterium-mediated transformed stylo increased the resistance of it against anthracnose. In this study, we plan to elucidate the mechanism of stylo resistance to anthracnose through secondary metabolite pathway regulated by SgPAL1. To dissect the transcriptional regulatory network of SgPAL1, the transcription factor of SgPAL1 will be analyzed using yeast one-hybrid system. To reveal the post-translational modification on the regulation of SgPAL1, the critical sites of SgPAL1 on biochemical properties and protein transportation will be studied. Our results could not only dissect the molecular mechanisms of SgPAL1 in stylo against anthracnose, but also provide theoretical base and candidate gene for breeding stylo cultivar with anthracnose resistance.

柱花草是重要的热带亚热带豆科牧草，炭疽病是威胁其生产的主要病害。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷次生代谢途径的第一个关键酶和限速酶，但PAL在植物抗炭疽病过程中发挥的功能与调控机制仍不清楚。前期工作中通过RNA-seq分析鉴定到1个受炭疽菌诱导表达的柱花草苯丙氨酸解氨酶基因SgPAL1，超量表达该基因显著增强柱花草对炭疽病的抗性。在此基础上，本项目将对转基因柱花草开展代谢组学分析，明确SgPAL1介导次生代谢途径参与柱花草抗炭疽病的作用机理；利用酵母单杂交等方法鉴定调控SgPAL1的上游转录因子并分析其功能，解析SgPAL1的转录调控网络；通过质谱技术鉴定SgPAL1蛋白的翻译后修饰位点，并分析位点突变对SgPAL1生化酶学性质和蛋白转运的影响，揭示翻译后修饰对SgPAL1的调控作用。研究结果将阐明SgPAL1参与柱花草抗炭疽病的分子机制，并为柱花草抗病品种选育提供理论依据和候选基因资源。

柱花草是热带地区广泛种植的豆科牧草，而炭疽病严重威胁其产业化种植。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，在植物抗逆反应中发挥着重要作用。本项目初步揭示了PAL在柱花草抗炭疽病中的功能，主要结果如下：（1）柱花草PAL基因家族有5个成员。生物信息学分析显示，该5个成员均含有苯丙氨酸解氨酶的保守结构域及胁迫响应、激素响应等多种顺式作用元件。在原核细胞中诱导表达SgPAL可检测到苯丙氨酸解氨酶活性，SgPALs定位于细胞质中。接种炭疽菌后，柱花草叶片中的SgPAL1/2/3/5表达量显著增加，其中SgPAL3的相对表达量最高，说明SgPALs在柱花草抗炭疽病过程中发挥作用。（2）转录组学和代谢组学分析表明，苯丙烷和类黄酮合成途径是柱花草响应炭疽菌侵染的一个重要途径，超量表达SgPAL的转基因柱花草T0代株系中，PAL酶活、总酚和类黄酮含量明显高于野生型，说明SgPAL的超量表达促进总酚和类黄酮的合成，表明SgPAL通过介导苯丙烷和类黄酮合成途径而增强了柱花草对炭疽病的抗性。（3）建立了柱花草炭疽菌与拟南芥的互作体系及宿主植物中胶孢炭疽菌的定量检测方法，有助于开展柱花草炭疽菌与植物互作的分子机理研究。证实了SgPAL是柱花草抗炭疽病的正调控因子；酵母单杂交、双荧光素酶实验确定了ETC2和bHLH099转录因子对SgPAL3基因具有转录调控作用；OE-SgPAL3拟南芥类黄酮、氨基酸合成增加，其苯丙烷代谢途径参与SgPAL3调控拟南芥抗炭疽病的过程。本项目研究成果表明柱花草通过上调类黄酮生物合成途径中的基因和化合物以应对炭疽菌的侵染，该研究成果有助于后续深入解析柱花草抗病机制和进行抗病品种选育。