肺炎克雷伯菌OXA-232型碳青霉烯酶的表达调控及遗传环境研究

Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with the extensively drug-resistant characteristic developed the great challenge for public health. Production of carbapenemase (class A, B and D) is the predominant resistance mechanism of K. pneumoniae to carbapenem. Compared with class A and B carbapenemase, class D carbapenemase OXA-48 like carbapenemase especiall OXA-232 is difference for both Hydrolysis substrate and the distribution among clinical strains. Our previous study indicated the prevalence of OXA-232 producing K. pneumoniae was rapidly increasing. In this study, we want to clarify the epidemiology, function of surrounding regulators and the gene expression of blaOXA-232 among K. pneumoniae. We try to clone different OXA-232-containing DNA fragments into a vector via restriction enzyme double-digestion technique. Then we try to analyze the horizontal transmissibility and evolution of OXA-232-harboring plasmids by bioinformatics software. The project may help to reveal the carbapenem-resistant mechanism in K. pneumoniae and might provide the basis for prevention and control of carbapenem-resistant strains.

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌由于具有广泛耐药特征使临床抗感染治疗面临无药可用困境。产生碳青霉烯酶（包括A、B和D类）是细菌对碳青霉烯类药物最主要的耐药机制。与A和B类碳青霉烯酶不同的是，以OXA-232为代表的D类OXA-48家族碳青霉烯酶在水解底物谱上有明显差别，且其在我国临床分离菌株中的流行分布特征未明。课题组前期研究发现，近年肺炎克雷伯菌中OXA-232型碳青霉烯酶的检出率快速上升。本研究①通过多中心样本研究，分析产OXA-232型酶肺炎克雷伯菌在我国的流行和分布；②通过酶切克隆方法获得OXA-232基因及其周边调控基因序列，RT-PCR及测序阐明调控基因序列及结构改变对OXA-232基因表达水平及耐药表型的影响，揭示表达调控机制；③通过质粒携带OXA-232基因遗传环境生物信息学分析，探索耐药基因起源和传播机制；通过本课题研究，可进一步揭示并丰富细菌对碳青霉烯类的耐药机理。

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌由于具有广泛耐药特征使临床抗感染治疗面临无药可用困境。产生碳青霉烯酶（包括A、B和D类）是细菌对碳青霉烯类药物最主要的耐药机制。与A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属内酰胺酶不同的是，以OXA-232为代表的D类OXA-48家族碳青霉烯酶在水解底物谱上有明显差别，且其在我国临床分离菌株中的流行分布特征未明。本研究收集2016-2021年全国50所医院临床分离1618株碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（CRE），碳青霉烯酶基因检测结果显示，CRE菌株所产碳青霉烯酶以KPC（58.8%）、NDM（31.5%）和OXA-232（6.1%）型碳青霉烯酶为主。对99株产OXA-232型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（OXA-232-Kp）的研究结果发现，儿童和成人患者分离株分别占66.7%和33.3%。药敏试验结果显示，OXA-232-Kp对包括厄他培南、头孢菌素、氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物耐药率高，但部分OXA-232-Kp对亚胺培南和美罗培南敏感或中介。对81株OXA-232-Kp全基因测序结果显示，所有菌株均携带blaCTX-M-15、blaTEM-1B、blaSHV、质粒介导氨基糖苷类耐药基因 rmtF、编码氨基糖苷类修饰酶N-乙酰转移酶基因aacA4'-17以及质粒介导喹诺酮耐药基因qnr-like（qnrB1 82.7%%；qnrS1 17.3%）。OXA-232-Kp菌株MLST分型主要为ST15型（81.5%，66/81）和ST231（17.3%，14/81）和ST-V（1.2%，1/81），携带相同的blaOXA-232的遗传环境，blaOXA-232位于大小为6141bp的ColE型质粒上。此外，外膜蛋白OmpK36缺失导致OXA-232-Kp对碳青霉烯类敏感性下降。本研究结果提示含OXA-232质粒可在不同菌株间水平传播，呈克隆播散趋势。本研究结果亦证实了课题申请时的推测，即OXA‐232型碳青霉烯酶将成为第3种在我国临床分离菌中广泛流行的碳青霉烯酶。