碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌对黏菌素天然耐药的调控机制研究

The emergence of colistin-resistant carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) leads to a dilemma of no-drug for selection to treatment for clinician. Our previous study on CRE isolates indicated (JCM,2011,49:4022) that 4 CRE isolates were resistant to colistin but all the patients had no history of colistin using. These 4 isolates may intrinsic resistant to colistin and the resistant mechanism should be identified urgently. This project will evolve intensively following study: ①To compare the difference of lipopolysaccharide structure between colistin intrinsic resistant and susceptible isolates through the analysis of lipopolysaccharide structure modification by mass spectrographic analysis in order to interpret the intrinsic resistant mechanism of CRE isolates to colistin. ②To study on the regulated mechanism of CRE resistant to colistin through gene site-directed mutagenesis and clone technology. Compare the difference of mRNA transcription and expression level of PmrA and its activated genes between colistin-resistant and susceptible isolates by RT-PCR.③Through analysis the inherited environment of PmrA by DNA sequencing technology, understand the formed mechanism of different phenotype strains to colistin。Our studies can provide theoretical background for controlling the spread of colistin-resistant isolates and give a reference for developing new antimicrobial agent for infections due to colistin-resistant isolates.

碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）对黏菌素耐药使临床陷入彻底无药可用的困境。我们课题组前期的研究发现（JCM,2011,49:4022），4株CRE菌株对黏菌素耐药，但患者并无黏菌素治疗史，提示该菌株对黏菌素天然耐药，其耐药机制亟待明确。本课题拟重点开展以下研究：①采用质谱分析技术对黏菌素天然耐药和敏感株脂多糖成分的结构进行解析，比较不同菌株的脂多糖在结构修饰上的差异，阐明细菌对黏菌素的天然耐药机制。②采用基因定点突变和克隆技术，分析CRE菌株对黏菌素天然耐药的调控机制，RT-PCR相对定量比较黏菌素耐药和敏感株中PmrA基因及其调控子在mRNA表达水平上的差异。③周边序列测序分析PmrA基因的遗传环境，明确黏菌素不同耐药表型菌株的形成机制。通过上述研究为控制黏菌素耐药菌株的流行传播提供理论依据，为开发针对黏菌素耐药菌株引起感染的新抗菌药提供实验依据。

碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的药物，但碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）的出现使临床抗感染治疗陷入无药可用的困境。多黏菌素被认为是治疗CRE所致感染的最后一道防线。我国目前尚未批准临床使用多黏菌素类药物，但本课题组前期研究发现（JCM,2011,49:4022），4 株临床分离的CRE菌株对黏菌素耐药，但患者并无黏菌素治疗史，提示该菌株对黏菌素天然耐药，其耐药机制亟待明确。本课题以细菌耐药监测网为平台，收集全国临床分离的肠杆菌科细菌，筛选多黏菌素天然耐药菌株，通过分子生物学方法明确肠杆菌科细菌对多黏菌素的耐药调控机制。主要研究内容和结论如下：(1)临床分离肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药率较高尤见于肺炎克雷伯菌，但其对多黏菌素（除外黏质沙雷菌、变形杆菌等多黏菌素天然耐药菌）的耐药率极低。(2)本研究结果显示，细菌对多黏菌素耐药，反而会对其他抗菌药物敏感，包括碳青霉烯类、酶抑制剂合剂等。(3)多黏菌素耐药相关基因多见于肺炎克雷伯菌中，其他肠杆菌科细菌少见。耐药菌株相对敏感菌株，pmrA/pmrB及PhoP/PhoQ双组份调控系统相关基因表达呈现不同程度表达上调，其在介导多黏菌素耐药中发挥着重要作用；(4)双组份调控系统相关基因的表达参与多黏菌素体外诱导耐药，但同时存在着其他机制。RNAseq及qRT-PCR发现诱导耐药菌株相对原始菌株pulE、pulD、pulL、pulH、pulG等细菌II型分泌系统中的6个基因表达上调，推测其参与调节肺炎克雷伯菌体外诱导耐药。(5)基因敲除试验证实mgrB确为多黏菌素耐药的关键负调控子。qRT-PCR对已报道的其下游调控通路基因进行验证，并未发现PhoP等相关基因表达明显上调，提示mgrB参与其他通路调控多黏菌素耐药。(6)质粒介导mcr-1基因在临床分离的菌株中少见，检出率低于5%，这可能与目前临床并无多黏菌素可用有关。一旦多黏菌素被批准正式用于临床，随着多黏菌素使用量的增加，加上多黏菌素及其容易被诱导耐药，其耐药性不容乐观。