单纯疱疹病毒介导的尿氨酸氨基转移酶基因逼尿肌注射治疗胸10脊髓横断大鼠逼尿肌过度活动的探索

Suprasacral spinal cord lesions usually lead to detrusor overactivity，detrusor - sphincter dyssynergia and detrusor fibrosis. Detrusor overactivity is closely related to unsafe bladder pressure and low bladder compliance, which seriously threats patients'upper urinary tract function, but there is no ideal way to inhibit detrusor overactivity. Evidences showed harmful stimulation to bladder or spinal cord could increase excitatory neurotransmitter of glutamate in dorsal root ganglia, which can lead to detrusor overactivity. Kynurenic acid is a noncompetitive inhibitor for one of glutamate receptor- - NMDA receptor, which is generated by irreversible catalysis of kynurenine aminotransferase in the process of tryptophan metabolism. Neurotropic herpes simplex virus is a commonly used viral vector for gene therapy research, which could infect rat L6-S1 dorsal root ganglia along peripheral nerve axons in a retrograde manner. In this study, we first construct herpes simplex virus mediated kynurenine aminotransferase gene vector, then use it to explore the possibility and mechanisms of inhibition of detrusor overactivity by bladder wall injections in rats with T10 spinal cord transection.

骶上脊髓病变常导致逼尿肌过度活动(Detrusor overactivity,DO)、逼尿肌-括约肌协同失调和逼尿肌纤维化,因此产生的膀胱内高压及膀胱顺应性降低等改变严重威胁脊髓病变患者上尿路功能。但目前没有抑制DO的理想方法。有证据表明，脊髓和膀胱受到有害刺激时，脊髓背根神经节神经元内兴奋性神经递质谷氨酸的含量增加，并可导致逼尿肌的过度活动，因此降低谷氨酸受体活性以期抑制DO是本研究的假说。尿喹啉酸是谷氨酸NMDA受体的非竞争性抑制剂，它是在色氨酸代谢过程中，由尿氨酸氨基转移酶不可逆性催化下生成。单纯疱疹病毒是基因治疗研究中常用的病毒载体，能沿周围神经轴突，逆行感染大鼠L6-S1背根神经节神经元。在本研究中，我们首先构建单纯疱疹病毒介导的尿氨酸氨基转移酶基因病毒载体，将该病毒载体注射入T10脊髓横断大鼠的膀胱壁内，探索单纯疱疹病毒介导的尿氨酸氨基转移酶基因治疗脊髓病变后DO的可能性与机制

背景：骶上脊髓病变常导致逼尿肌过度活动和逼尿肌-括约肌协同失调等，严重威胁脊髓病变患者上尿路功能。但目前对此缺乏相关的理想治疗方法。在慢性脊髓损伤，抑制N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体能够改善逼尿肌过度活动和逼尿肌-括约肌协同失调。尿喹啉酸是谷氨酸NMDA受体的非竞争性抑制剂，由尿氨酸氨基转移酶不可逆性催化生成。单纯疱疹病毒是基因治疗研究中常用的病毒载体，能沿周围神经轴突逆行感染大鼠L6-S1背根神经节神经元或骶髓排尿中枢。主要研究内容：1）构建KATⅡ基因复制缺陷HSV-1载体：HSVrd-KATⅡ (RFP)病毒载体；2）动物实验：制作T9-10脊髓横断大鼠模型；病毒载体膀胱壁或尿道壁注射；检测大鼠尿动力；3）基因表达: 检测大鼠L6-S1背根神经节和骶髓排尿中枢尿氨酸氨基转移酶mRNA、蛋白质表达；4）探讨机制：大鼠背根神经节神经元原代培养，转染HSV和HSV-KATⅡ后，检测尿喹啉酸水平、NMDA受体活性、神经元兴奋性；5)扩展研究：3）制作间质性膀胱炎大鼠模型与醋酸诱导的膀胱过度活动模型，并经膀胱壁注射HSV-KATⅡ，进行大鼠膀胱测压及L6-S1背根神经节尿氨酸氨基转移酶mRNA、蛋白质表达检测。重要结果与关键数据：1）经SCI大鼠膀胱壁或尿道壁注射HSVrd -KATⅡ后，最大漏尿点压力和最大尿道压力皆显著降低（分别为46.7-56.2%和34.7-39.1%，31.6%-30.9%和23.6%-24.9%），非排尿性收缩频率和幅度显著降低，排尿效率明显提高；2）L6-S1背根神经节和骶髓排尿中枢的KATⅡmRNA和蛋白表达水平明显增加；3）通过全细胞膜片钳法检测KYNA能够阻断正常神经元NMDA受，HSVrd-KATⅡ病毒转染可以降低神经元对NMDA的反应；4）间质性膀胱炎组模型大鼠行为学观察与最大膀胱容量与对照组相比有显著差异；膀胱过度活动组非排尿性收缩数量显著减少；两模型中L6-S1背根神经节KATⅡmRNA和蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）。。意义：探索出一项治疗膀胱功能障碍的新方法；由于膀胱功能障碍患者群体庞大，该病变严重影响患者生命质量，对社会和家庭造成沉重经济负担以及现有的治疗措施效果不满意，因此，该研究具有一定的科学价值、社会意义与经济价值。