Innexin的功能及其与pI3K/Akt信号通路调节昆虫细胞免疫反应的研究

Gap junction (GJ), specialised membrane structures that mediated intracellular communication through forming gap junction channel between two neighboring cells, intracellular and extracellular communication by forming hemichannel (innexon) in the cell surface is well known in the vertebrate. A few studies also report that GJ also regulate cell cycle in the cell nuclei by single protein. GJ terms innexin (Inx) in the invertebrate. Previous study shows that inx promote cell apoptosis and aggregation in different insect cell type involving in the dephosphorylation of PI3K/Akt signaling pathway. Based on previously studies and most recent reports, we propose a hypothesis that Inx may perform a triple function to regulate nodule and aggregation during insect innate cellular immunoresponse, also regulate cell apoptosis. To test hypothesis, we will employ transcriptome sequencing, molecular biology technology and combine insect immunity methods to test this hypothesis: single Inx localizes in the cell nucleus to regulate aggregation via cyclin D (CCND); Innexon localizes in the cell surface to regulate cell apoptosis via dephosphorylation of pI3K/Akt to activate caspase 3. GJ is responsible for transmitting two information, aggregation and apoptosis, between two cells during encapsulation forming. This study will expand understanding of innate cellular immunoresponse. In addition, the results will be a good source for screening of novel molecular target gene for biology control.

Innexin (Inx)蛋白是一个重要的昆虫免疫蛋白。前期的研究已经表明Inx在不同的细胞中分别有促进细胞凋亡和聚集的功能，与pI3K/Akt磷酸化相关。本项目抓住Inx蛋白以Inx单体，Inx6聚体(Hemichannel/Innexon)和Gap junction (GJ)存在细胞中执行三种功能，这一关键问题，提出科学假说：Inx参与到昆虫细胞免疫的结节、凋亡和包囊反应中。本申请拟采用转录组学、分子生物学和昆虫免疫学的方法和手段加以实验验证， 即Inx的表达促进pI3K/Akt去磷酸化，定位于细胞核的Inx与周期蛋白CCND相互作用，调控细胞聚集；位于细胞膜表面的Innexon，激活caspase3，导致细胞凋亡；位于相邻两个细胞表面的GJ，传递上述两种细胞信息，在包囊形成过程中产生细胞的聚集和凋亡。这个假说的证明将促进昆虫细胞免疫的研究，为害虫的生物防治提供新的免疫分子靶标。

Innexin (Inx) 在先天免疫反应中被调控，然而，其在先天免疫抑制中的作用及其调控机理却仍然不清楚。.Inxs维系细胞的完整性，基因的缺失可以直接诱导细胞的凋亡，或者在寄生蜂寄生诱导产生的凋亡细胞的背景下促进细胞的凋亡。在研究中发现，inx1和inx2的缺失，能够直接诱导细胞的凋亡；相反，inx3和inx4的缺失并不能直接诱导细胞凋亡。深入的研究发现，在寄生蜂寄生后产生的细胞凋亡背景下，缺失4个inxs，都能显著促进细胞的凋亡。有趣的发现是，分别用缺失inx1和inx2作为细胞凋亡的诱导因子时， inx3和inx4的缺失并不能促进细胞的凋亡；但是，这种促进细胞凋亡的现象在缺失inx4中再现，当在增加寄生蜂寄生诱导细胞凋亡的背景下。研究结果表明，寄生蜂的寄生能诱导产生一种因子，该因子能进一步调控inxs，进而促进细胞的凋亡。.茧蜂病毒诱导细胞凋亡的过程中产生能进一步调控inxs的生物因子。研究中发现茧蜂病毒通过调控细胞pI3K/Akt信号通路, 促进Akt的两个磷酸化位点去磷酸化，进而激活Caspasp3。茧蜂病毒编码的病毒蛋白参与到免疫抑制的过程中， 包括Vank锚蛋白和PTP蛋白酪氨酸磷酸酶。研究发现，茧蜂病毒编码的Vanks蛋白能与细胞核中的转录因子dip3相互结合，抑制Dip3的活性，导致部分由dip3调控的下游基因的mRNA转录下降，其中包括翻译起始因子eIF4E。 Dip3直接调控eIF4E的转录，当Dip3被抑制时，导致了eIF4E的mRNA转录受抑制，由于mRNA的减少进而导致eIF4E的蛋白水平降低。 合理论性的发现，eIF4E的降低，导致p85的翻译被抑制。意外的发现是p85蛋白的减少，竟然导致了Akt-pSer473去磷酸化。同时，寄生蜂病毒蛋白PTP109显著促进Akt-pThr308去磷酸化，并伴随着caspase3的激活。结果表明，寄生蜂的寄生导致来了 Akt两个磷酸化位点去磷酸化，产生激活的Caspase3。.综上所述，inxs维系细胞的完整性，在茧蜂病毒导致的细胞免疫抑制下，pI3K/Akt去磷酸化，激活Caspase3来进一步调控inxs，促进细胞的凋亡。该研究结果为进一步阐述免疫抑制的分子机理打下了坚实的基础，研究成果可直接用于指导害虫的生物防治，为开拓创新生物防治的理论和方法有着重要的意义。