设计改造羧酸还原酶合成重要医药中间体（S）-2-氨基丁醛的研究

(S)-2-aminobutanal is an important intermediate in the synthesis of antituberculous and antiepileptic drugs. The synthesis of (S)-2-amniobutanal is mainly depended on chemical methods, which are not environmentally friendly along with long synthetic routes. Yet the known bioenzymatic synthesis is limited by the low activity of carboxylic acid reductases. In order to improve the activity, a carboxylic acid reductase from Segniliparus rugosus is chosen to reduce (S)-2-aminobutyric acid by engineering its catalytic pocket. Assisted by molecular dynamics (MD) simulations and quantum mechanics (QM) calculations based on X-ray structures, the key residues related to the substrate specificity (α-substituent group) and activity will be subjected to engineering by triple-code saturation mutagenesis (TCSM) to efficiently reduce (S)-2-aminobutyric acid to (S)-2-aminobutanal, shedding light on the mechanistic intricacies of the enzyme and providing theoretical and practical guidance for the same type of enzyme reaction and engineering.

（S）-2-氨基丁醛是抗结核及抗癫痫药物的重要前体。目前主要依赖化学法合成，污染大且合成路线长；虽有生物酶法研究，但因野生型羧酸还原酶催化效率较低，难以满足生产需求。针对上述问题，本项目拟设计改造塞格尼氏杆菌（Segniliparus rugosus）来源羧酸还原酶SrCAR的催化口袋，提高对（S）-2-氨基丁酸的底物特异性及催化活性。基于晶体结构，通过分子动力学模拟（MD）及量子化学（QM）计算，定位与底物特异性（α-碳原子取代基）及催化活性相关的关键氨基酸残基位点；采用三密码子饱和突变（TCSM）策略对选取位点进行设计和改造，结合计算机虚拟筛选技术并进行实验验证，最终获得能高效还原（S）-2-氨基丁酸为醛产物的最优突变体。通过解析最优突变体的分子催化机制，揭示该酶底物催化结合口袋重塑设计与底物特异性及催化活性之间的适配规律，为其它同类型酶设计改造提供理论和实践指导。

羧酸还原酶可催化多种有机酸并还原为醛产物，然而对氨基酸类底物的活性较差。本项目以塞格尼氏杆菌来源羧酸还原酶SrCAR为研究对象，以其催化（S）-2-氨基丁醇到（S）-2-氨基丁醛为模式反应，理性设计该酶催化口袋，提高对（S）-2-氨基丁酸的底物特异性及催化活性。基于晶体结构，通过计算设计，定位与底物特异性（α-碳原子取代基）及催化活性相关的关键氨基酸残基位点；采用三密码子饱和突变（TCSM）策略对选取位点进行设计和改造，结合计算机虚拟筛选技术并进行实验验证，最终获得系列高效还原（S）-2-氨基丁酸为醛产物的突变体。此外，通过调控催化反应条件，还实现了CAR催化ω-氨基酸的分子内酰胺化新反应，本项目揭示了该酶底物催化结合口袋重塑设计与底物特异性及催化活性之间的适配规律，并拓展了羧酸还原酶的应用场景及催化反应类型。