南极假丝酵母脂肪酶B展示过程中“锚定”与“分泌”两种类型共存的机制及调控

南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）利用絮凝素Flo1p的N端絮凝功能结构域（FFD）在毕赤酵母表面展示时，同时存在aCALB(锚定在细胞壁壁)与sCALB（分泌到发酵液中）两种形式。sCALB可能是外源CALB完成展示的"过渡态"。本项目利用基于FFD的表面展示系统实现CALB在毕赤酵母细胞表面的活性展示，通过研究aCALB与sCALB糖基化程度、是否单体聚合，解释"锚定"与"分泌"的分子量或结构差异；同位素示踪、诱导过程跟踪和甘露糖抑制实验，研究aCALB与sCALB蛋白积累和酶活变化规律以及单个酵母细胞表面酶展示量的变化阐明sCALB可能是外源CALB完成展示的"过渡态"。进一步通过控制C源、温度、比生产速率等参数，研究aCALB与sCALB两种蛋白的调控机制。本研究为外源脂肪酶在酵母细胞表面实现展示的动态过程以及展示机制的阐明奠定理论基础，也对实现脂肪酶在酵母细胞的高效展示有指导意义。

外源脂肪酶展示在酵母细胞表面，表现出耐温、耐有机溶媒、回收方便/可重复使用等优良特性，正成为继固定化酶之后新的酶制剂形式。但单位酵母细胞表面展示酶催化效率较固定化酶低是制约其发展的重要瓶颈。了解脂肪酶在酵母细胞表面的展示剂量、调控机制对丰富酵母展示理论和指导改善酵母细胞表面展示效率有重要意义。. 酿酒酵母絮凝素Flo1作为锚定蛋白，其N 端絮凝功能区(flocculation functional domain，FFD)能识别并且以非共价键连接到细胞壁的甘露聚糖复合物上，外源蛋白以C 端游离的形式展示在酵母细胞表面，称为FFD锚定系统。本课题首先完善和建立了一套毕赤酵母的细胞壁蛋白的分类、提取方法，采用hot-SDS法可有效提取基于FFD系统锚定在酵母细胞壁上的脂肪酶。接着实现了毕赤酵母细胞表面展示的酶蛋白分子数的直接定量。利用增强型绿色荧光蛋白EGFP作为标记蛋白，发现FFD系统展示南极假丝酵母脂肪酶B （CALB）时，两种重组菌发酵上清中均存在相同程度的“泄露”，且泄漏到上清中的蛋白与锚定在酵母胞壁上的展示蛋白结构一致。将上清中蛋白量与相对荧光强度的对应规律类比到酵母细胞壁锚定蛋白，建立了酵母细胞壁锚定蛋白相对荧光强度与细胞表面蛋白载量的对应关系。首次直接验证了在毕赤酵母细胞壁上利用FFD系统锚定的蛋白为16000个/细胞。. CALB利用FFD在毕赤酵母表面展示时，部分CALB活性的蛋白泄露到重组酵母发酵上清中，称为分泌型（secreted CALB）。脱落到细胞上清中的sCALB有两种形式：一种为大分子融合CALB（big secreted CALB, bs CALB），经质谱鉴定为絮凝素与CALB的融合蛋白，分子量216kD，等电点3.97，与固定在细胞壁上的aCALB实为同一种分子。另一种为小分子CALB（small CALB，ssCALB）,该分子为约37kD，与游离CALB分子量相当。bsCALB与ssCALB对发酵液酶活贡献为3:1。aCALB,ssCALB，bsCALB 都存在N和O 糖基化，且bsCALB 和aCALB的糖基化程度接近。但糖基化不是造成展示过程中脂肪酶泄漏到上清的主要原因。 改变重组酵母的碳、氮源、氨基酸添加量以及温度等培养条件，可轻微改变aCALB与sCALB的量和比例。