酵母细胞壁多糖合成途径挖掘及其关键基因的表达调控机制

Glucan and mannan are polysaccharides with high biological activity, and Saccharomyces cerevisiae is one of the important sources of natural polysaccharides. On the one hand, we can not fundamentally improve the characteristics of the strain by optimization of fermentation conditions. On the other hand, the direction of mutagenesis breeding is also hard to control. At present, the studies of regulation of polysaccharide synthesis pathway or mechanism are limited to several genes involved in the synthesis of polysaccharide skeletons. Overall research of the complicated dynamic balance of cell wall polysaccharide and the cell integrity signaling pathways are almost unavailable. Therefore, the aim of our project is to analysis cell wall polysaccharide synthesis gene and regulatory network of Saccharomyces cerevisiae using genetic engineering operation, such as Knock out and over expression combining with transcriptome and iTRAQ technology, based on Rho1, Bck1, Rlm1 and other newly discovered genes involved in cell wall integrity. In this way, polysaccharides genes and correlative metabolic pathway related to Saccharomyces cerevisiae cell wall will be accurately regulated at molecular level. Thus, the study on the mechanism of cell wall polysaccharide synthesis will be enriched and improved greatly. This study will also provide a new idea which helps to construct food-grade high-yield polysaccharide strains.

葡聚糖和甘露聚糖是生物活性显著的多糖，而酿酒酵母是其重要来源之一。优化发酵条件或诱变育种得到高产多糖酵母的方法，不能从根本上改善菌株特性或是进化方向难以掌握。目前，对多糖合成途径的调控和机制研究也多局限在已知的几个参与多糖骨架合成的基因。对于细胞壁多糖合成基本途径和涉及多糖合成的细胞壁完整性途径中错综复杂、环环相扣的多糖动态平衡缺乏全局性的深入研究。因此，本项目拟通过Rho1、Bck1、Rlm1等多个新近发现的、参与细胞壁完整性的基因功能研究，采用敲除、过表达等手段结合转录组学及iTRAQ技术分析酿酒酵母细胞壁合成途径相关基因及其产物调节网络，合理、高效和精准调控酿酒酵母细胞壁多糖代谢通路，从分子水平精准解析、靶向调控酿酒酵母细胞壁多糖代谢通路，丰富和完善细胞壁多糖合成机制的两条途径，为食品级酿酒酵母高糖菌株的质量提升提供新的思路和依据。

酿酒酵母是重要的工业生物宿主，也是研究真核生物的细胞基因功能及细胞代谢的代表性模式生物。酵母细胞壁多糖具有显著的生物活性，高糖酵母的构建及细胞壁靶向的抗真菌药物开发等都需要对酵母细胞壁合成和调控机制有着充分的认知。因此，本项目通过采用敲除、过表达等手段结合多组学技术包括iTRAQ技术、RNA-Seq技术、化学基因组学方法对细胞壁合成调控基因及通路进行了全面的解析。首先对细胞壁合成相关基因的过表达和多糖含量进行了测定。对FKS1敲除菌进行了RNA-Seq转录组学、iTRAQ蛋白质组学分析，并根据组学数据过表达调控因子，实现了非压力下高糖酵母菌株的构建。建立了两套酵母基因编辑质粒，实现了酵母的快速遗传操作；建立基于细胞壁干扰剂的全基因组水平挖掘细胞壁合成和调控相关基因的高通量筛选方法；建立了细胞壁完整性途径激活传感器，为研究细胞壁完整性途径开发了便捷的工具。此外，本研究采用化学基因组学方法，筛选了细胞壁干扰剂荧光增白剂（CFW）和十二烷基硫酸钠（SDS）敏感和抗性菌株，利用生物信息学方法分析了响应细胞壁干扰剂的全局调控网络。研究深度剖析了酿酒酵母细胞壁多糖合成基本途径和非压力条件下的细胞壁补偿途径在细胞壁合成中的相互影响机制。测定了突变菌株的细胞壁几丁质相对含量，并对菌株的细胞壁完整性（CWI）途径激活情况进行了研究。通过多组学数据挖掘出了细胞壁完整性维持相关新的转录因子，新途径等，并对新的关键基因进行了进一步验证分析。同时，本研究开展了毕赤酵母细胞壁合成或壁蛋白基因的缺失对细胞壁组分的影响及应用。细胞壁改构菌株可以作为优良的多糖生产和酶蛋白展示的宿主。