Foxo1-KLF2-S1P1对重症肌无力患者胸腺细胞成熟及输出调控机制的研究

FoxO1-KLF2-S1P1 axis is the critical factor in mature CD4 or CD8 single positive thymocytes(SP thymocytes) emigration from thymus. Myasthenia gravis is an autoimmune disease mediated AChR antibodies and associated with T lymphocytes. There are often abnormalities of thymocytes and blood T cells subsets in MG. To assess the relationships between the periphery T cell subsets and abnormal MG-thymus, we have found FoxO1,KLF2,CD69,CCR7 and S1P1 expression up-regulation in MG thymic tissue used by immunohistochemisty, flow cytometry and real time PCR.We'll sorting further CD3+CD4+CD8- and CD3+CD4-CD8+ SP thymocytes from single-cell suspensions of MG thymus.FoxO1 gene or siRNA for FoxO1 will be transfected into SP thymocytes.The FoxO1 expression in SP thymocytes will be regulated using gene transfection, gene silencing and FoxO1 phosphorylation, dephosphorlation. The downstream moleculars of FoxO1,such as KLF2 CD62L CCR7 and S1P1, will be analyzed using western blot. The abilities of mature SP thymocytes export from MG thymus will be observed using Transwell migration and human MG thymus grafted-SICD mice model. These discoveries will be the first detailed analysis of the FoxO1-KLF2-S1P1 axis in MG thymus and likely to result in significant therapeutic application.

FoxO1/KLF2/S1P1是控制胸腺成熟T细胞从胸腺迁出发挥功能的关键。重症肌无力是自身免疫病，患者胸腺细胞和外周血T细胞亚群存在显著异常。为深入探讨其机制，本研究已通过免疫组化、流式细胞术、荧光定量PCR发现并证实胸腺细胞FoxO1、KLF2、S1P1表达与对照组存在差异，且FoxO1的下游产物CD62L、CCR7表达异常。因此，我们拟进一步通过流式细胞仪分选出CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+分化成熟阶段的单阳性胸腺细胞，采用FoxO1基因转染、基因沉默、FoxO1磷酸化和去磷酸化等手段调节FoxO1在细胞的表达，观察其对KLF2、CD62L、CCR7和S1P1等分子表达的影响，通过体内、外试验分析胸腺细胞输出的调控机制，在理论上揭示FoxO1/KLF2/S1P1轴在重症肌无力胸腺及外周T细胞亚群异常中的作用，寻找调控胸腺细胞输出的分子靶点，为临床疾病诊治提供依据。

本研究通过对MG胸腺Foxo1-KLF2-S1P1通路的研究，首先明确了Foxo1、KLF2、S1P1、CD62L等分子在MG患者胸腺表达显著增高，主要分布于胸腺髓质区，且与血管内皮分子CD31的分布一致，提示Foxo1-KLF2-S1P1通路在MG患者免疫细胞输出中发挥重要作用。然后通过体外试验，发现Foxo1慢病毒表达和干扰载体转染可使CD4+T细胞KLF2和S1P1表达发生相应变化；CD3/CD28单抗可使TCR信号活化并通过PI3k-AKT途径使CD4单阳性胸腺细胞Foxo1磷酸化，其下游分子KLF2、CCR7、S1P1和CD62L表达降低，PI3k-AKT信号阻断剂LY294002能扭转这些分子的表达；另外，miR-19a-3p在MG患者胸腺表达显著降低，我们用miR-19a-3p mimic转染TALL-104细胞，发现它对T细胞增殖无影响，但能降低细胞凋亡，BCL2表达增高，Foxo1、KLF2 mRNA水平也有变化，提示miR-19a-3p可作为Foxo1的上游调节因子调控Foxo1的表达及细胞凋亡。最后，我们通过制作大鼠EAMG模型，发现EAMG大鼠Foxo1、KLF2、S1P1在CD4单阳性和双阴性细胞表达增高，CD4+CD8-IL-17+细胞显著增加。分选出EAMG胸腺CD4单阳性细胞，通过与骨髓树突状细胞共培养、在AChR多肽和IL-2存在条件下，S1P能促进CD4单阳性细胞分泌IL-5、IL-6、IL-17a和IL-22，减少IFN-γ的产生，提示S1P-S1P1信号除了影响成熟T细胞迁出胸腺之外，还能在AChR抗原刺激下促进炎症相关细胞因子产生。我们在EAMG的研究中还发现了另一种产生IL-17的细胞（γδT17细胞），γδT17细胞占γδT细胞的比例在EAMG组显著高于对照组，主要分布于胸腺血管丰富的皮髓交界处，这群细胞几乎都表达S1P1。分选出γδT细胞经CD3单抗刺激、在S1P作用下，产生IL-2、IL-6、TNFα、IL-17A和IL-17E能力显著高于对照组，提示EAMG胸腺γδT细胞更易行使炎症功能。本研究不仅证实了Foxo1及下游分子在MG患者表达异常，还探讨了调控Foxo1的机制，并在EAMG模型发现新的MG发生相关细胞亚群，这都将为MG发生发展及临床干预措施的改进提供科学依据。