组氨酸激酶AlHK1调控烟草赤星病菌（Alternaria longipes）致病相关基因的筛选与功能分析

Tobacco brown spot disease (TBSD) is one of the important diseases of tobacco all over the world, which restricts tobacco planting and production in our country. In recent years, the mechanism study of pathogenicity of the pathogen of TBSD has been attracted attention. In the previous studies, our project group discovered the group III histidine kinase AlHK1 was a key pathogenic factor of Alternaria longipes, which performed the pathogenic function by a negative manner. In this project, firstly, we plan to choose wild-type strain, AlHK1 gene point mutant and AlHK1 gene disrupted mutant of A. longipes from our previous work as study materials. Then, use suppression subtractive hybridization technique and bioinformatics method which based the "Interolog" approach to identify pathogenicity associated genes which regulated by AlHK1. Next, some genes mutants will be obtained using gene knock-out technology, and compare the differences in phenotype, pathogenic ability and reasons etc between the wild-type strain and the genes disrupted mutants to clarify their functions in pathogenic process. Finally, found the pathogenic model of "AlHK1-key pathogenic factors-phenotypic effects", which will lay a foundation for interpreting the molecular mechanism of pathogenicity of A. longipes, and provide theoretical basis for prevention and cure of the fungal diseases of plants.

烟草赤星病是一种全球性的重要烟草病害，严重制约我国烟草的种植和生产。近年来，烟草赤星病菌的致病机制日益受到人们的关注。在前期研究中，项目组发现第三类组氨酸激酶AlHK1是烟草赤星病菌（Alternaria longipes）的关键致病因子，AlHK1通过负性调控方式参与A. longipes的致病过程。本项目拟以前期工作获得的A. longipes野生型、AlHK1基因点突变菌株和AlHK1基因敲除突变株为研究材料，通过抑制消减杂交技术和基于"Interolog"方法的生物信息学手段筛选出AlHK1调控的致病相关基因，并利用基因敲除技术获得部分基因的缺失突变株，比较突变株与野生型菌株在表型、致病能力和原因等方面的差异，明确它们在致病过程中的作用，最终建立"AlHK1-关键致病基因-表型效应"的致病模型，为阐明A. longipes的致病分子机制奠定基础，也为植物真菌病害的防治提供理论依据。

本项目以烟草赤星病菌（Alternaria longipes）野生型菌株C-00和AlHK1敲除菌株HKΔ4为研究材料，在侵染穿刺烟叶产病斑时，利用抑制消减杂交技术获得211个差异表达基因（DEGs），选取21个可能与致病、信号转导、代谢等功能相关的基因进行敲除研究，通过同源重组，成功获得2个基因（pep1：编码天冬氨酸内肽酶；met1：编码5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸脱氨酶）的敲除菌株。功能分析发现，Met1可能与A. longipes的分生孢子形成相关。相对于野生型菌株，pep1敲除菌株在PDA培养基中菌丝较粗，菌落生长更快，产孢数显著减少，对有机渗透剂更敏感，对一些杀菌剂更耐受。此外，在不同碳氮源的MM培养基中，pep1敲除菌株的生长速率显著低于野生型菌株。致病性分析发现，pep1敲除菌株丧失了80%以上的毒力。这些结果说明，Pep1是一个关键致病因子，参与A. longipes多种生理过程。然而，Pep1是否直接受到AlHK1调控还有待深入研究。为了进一步阐述A. longipes致病性以及AlHK1在该过程中调控作用，通过共聚焦激光扫描显微镜对C-00与HKΔ4在未形成病斑时的侵染过程进行观察，发现在侵染早期和中期，C-00的菌丝侵染速率明显大于HKΔ4，而晚期情况正好相反。通过时间过程侵染转录组分析发现，在获得的4,637（C-00）和3,303（HKΔ4）DEGs中，有205个共有基因，505 C-00特有基因和222 HK∆4特有基因。肽酶，转运子，细胞色素P450和转录因子是共有基因中的优势基因，7个具有抗氧化胁迫活性的基因特异性存在于HKΔ4 DEGs中。共有基因可能在A. longipes致病性中发挥保守作用。为了研究C-00和HKΔ4侵染中的基因表达谱差异，共有基因中的优势基因的时间过程表达模式，GO富集条目和具有上升趋势DEGs簇的数目得到了分析，结果发现在C-00侵染中，改变主要存在早期和中期，而在HKΔ4侵染中，晚期是基因改变的主要时期。该现象同样存在于次生代谢物生物合成，分泌蛋白和碳水化合物活性酶等的基因表达模式分析结果中。这些结果一致说明致病因子AlHK1通过“后来居上”的方式调控A. longipes致病性。总之，我们的结果初步阐明了AlHK1调控A. longipes致病性的分子机制，为有效防治烟草赤星病提供了理论支撑。