棉铃虫Cry1Ac抗性显性遗传品系的抗性机理及适合度

Bt抗虫棉种植已达我国棉花总面积70%以上，Bt抗虫棉在大范围控制棉铃虫种群方面取得了显著成效，但棉铃虫对Bt抗虫棉的抗性问题是Bt抗虫棉长期成功的主要威胁。我们此前的研究已经从棉铃虫室内和田间种群中鉴定到导致对Bt毒蛋白Cry1Ac产生抗性的8个钙粘蛋白抗性等位基因，由该基因突变产生的抗性呈隐性遗传。2009年通过F2筛选从河南安阳田间种群中分离获得对Cry1Ac抗性为显性遗传的抗性品系（AY-R）。本项目拟从棉铃虫中肠蛋白酶与Cry1Ac的互作、非钙粘蛋白类Bt毒素受体的鉴定这两方面研究AY-R品系的抗性机理，并建立抗性基因的分子检测技术。现有抗性治理措施（庇护区策略）是建立在假设抗性为隐性的基础上，如果携带显性抗性基因的个体能在抗虫棉上存活，将给抗性治理带来巨大挑战。因此，本项目将研究AY-R抗性品系在室内饲养和田间条件下的适合度代价和生存能力，为制定针对性抗性治理对策提供理论依据。

在2009年和2011年分别从河南安阳地区棉铃虫种群中分离获得两个对Cry1Ac具有显性抗性的棉铃虫品系（AY423和AY2）。按种群增长趋势指数计算，AY423 的适合度为敏感品系90%，抗性品系适合度代价不明显。为了更好地研究AY423品系的抗性机理，将AY423与SCD敏感品系进行杂交、重复回交，并进行Cry1Ac筛选，成功构建了遗传背景与SCD一致的近等基因系SCD423。. 为了明确SCD423抗性品系中肠受体在Cry1Ac抗性形成中的作用，开展了以下研究。（1）克隆了10个Bt受体基因（HaCad, HaAPN1-6, HaALP1-2, HaABCC2），遗传分析表明这10个基因与Cry1Ac抗性不连锁；（2）利用实时定量RT-PCR技术比较了抗性品系SCD423与敏感品系SCD之间10个受体基因mRNA的表达量，各受体表达量差异较小，并通过Western Blot分析发现抗性与敏感品系HaCad受体在蛋白水平上的表达量没有差异；（3）利用ELISA法测定毒素与中肠BBMV饱和性结合，结果表明SCD423抗性品系和SCD敏感品系中肠BBMV与Cry1Ac的亲和力常数值分别为39 nM和25 nM，差异不明显。因此，棉铃虫中肠BBMV毒素受体的变异在SCD423品系的抗性形成过程中不起主要作用。. 昆虫中肠蛋白酶对Bt毒素的活化和降解有重要的作用，为此研究了SCD423品系是否因为中肠蛋白酶的改变而导致Bt抗性。结果表明：（1）SCD423品系中肠蛋白酶对模式底物的活性略高于敏感品系，同时对原毒素的活化也快于敏感品系；（2）在SCD423抗性品系中，蛋白酶抑制剂TLCK和TPCK对Cry1Ac具有显著增效作用；（3）胰蛋白酶基因HaSP6，HaSP7，HaSP9和HaSP24在SCD423抗性品系中的表达量分别是敏感品系的2.0，3.1，5.0和4.6倍。因为SCD和SCD423为近等基因系，因此这4个蛋白酶基因的上调与SCD423品系对Cry1Ac抗性具有连锁遗传关系。该结果在另一抗性性品系AY2中也得到证实。. 通过本项目的研究，明确了棉铃虫对Cry1Ac显性抗性的特征及分子机理-多个蛋白酶基因过量表达，有关基因过量表达的调控机理值得进一步探究。