β-D-葡萄糖醛酸苷酶的糖基化及其催化识别研究

以β-D-葡萄糖醛酸苷酶为对象，构建大肠杆菌（E.coli，无糖基化）、毕赤巴斯德酵母（P. pastoris，高甘露糖型糖基化）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO，复杂型糖基化）和野生产紫青霉（P.purpurogenum. Li-3，自然进化型糖基化）等四种不同水平的酶糖基化表达系统。研究四种不同表达系统所表达的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶学性质及催化反应动力学。通过确定β-D-葡萄糖醛酸苷酶在不同表达系统中的糖基化位点、种类及程度，并分析和计算酶糖基化后的构象及其折叠热力学参数，探讨不同糖基化方式及程度对酶分子结构、酶学特性的影响，阐明酶的糖基化与其催化识别的分子机理与基本规律，进而为酶分子的定向改造提供新思路和新方法。

以三种不同糖基化类型表达系统（产紫青霉P. purpurogenum Li-3自然进化糖基化型、大肠杆菌无糖基化型和毕赤巴斯德酵母高甘露糖糖基化型）表达的β-葡萄糖醛酸苷酶为对象，对三种酶进行分离纯化；确定该酶在不同表达系统中的糖基化水平；研究不同糖基化水平的酶学性质及催化反应动力学；分析和计算糖基化后酶的构象稳定性及热力学参数，探讨糖基化对酶催化特性和结构的影响，尝试将β-葡萄糖醛酸苷酶基因在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达，最后完成了在不同反应介质中的催化与转化GAMG的研究。主要结论如下：. 1） 纯化到产紫青霉、重组大肠杆菌和重组毕赤巴斯德酵母表达的β-葡萄糖醛酸苷酶（分别称为PGUS、PGUS-E和PGUS-P），其纯度分别为92.1%、98.3%和95.3%。糖基化分析表明，PGUS-P为N-糖基化翻译后修饰，而PGUS和PGUS-E无明显糖基化修饰；2）酶学性质比较分析表明，三种β-葡萄糖醛酸苷酶最适pH、最适反应温度、对底物对硝基苯-葡萄糖醛酸苷（PNPG）和甘草酸的催化反应动力学参数及催化水解甘草酸模式均有显著差异；3）去糖基化后的β-葡萄糖醛酸苷酶，其最适反应温度未明显变化，但最适pH值范围增大，对金属离子敏感性降低且与底物PNPG和甘草酸的亲和力均增强，耐变性剂、有机溶剂及表面活性剂能力均下降，更容易被胰蛋白酶水解且酶的热变性温度Td 和ΔH均下降，酶蛋白的热稳定性降低；4）经过近紫外圆二色和荧光光谱分析，去糖基化处理未改变β-葡萄糖醛酸苷酶酶蛋白的二级结构，但诱导了酶蛋白分子伸展及其三级结构的改变，N-糖基化有利于提高酶蛋白去折叠中间态的自由能变ΔG，从而增加其构象稳定性；5）尝试将β-葡萄糖醛酸苷酶基因在CHO中进行表达，实现了复杂糖型酶的糖基化，获得具有催化特异性的重组β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-C），并初步研究了其酶学特性；6）利用三种表达系统的全细胞为催化剂分别在不同的离子液体中进行生物转化合成GAMG的结果显示，全细胞酶PGUS在[Bmim]PF6/水双相介质体系中可以有效的合成GAMG。与传统发酵法相比，全细胞PGUS催化缩短了催化时间，提高了生产效率，具有较好的稳定性和重复使用性。. 在该基金的资助下，共发表SCI论文14篇，国际会议论文18篇，国内会议论文6篇，共培养研究生8名，其中博士3名。