分枝杆菌来源的cAMP对宿主细胞自噬抑制的调控机理研究

自噬是哺乳动物控制胞内感染的一种重要的免疫机制，但结核分枝杆菌(M. tb)却能抑制这一过程，并且自噬抑制的发生与cAMP水平增加相关。M. tb感染后可感应宿主细胞内的压力损伤，可通过腺苷酸环化酶(ACs)调节cAMP水平进行压力适应调控，且敲除ACs基因的感染试验表明敲除株在巨噬细胞内生长缺陷，感染动物存活率提高，提示cAMP参与介导了M. tb适应宿主体内的免疫防御。本研究中，我们拟用BCG作为模式菌，通过建立体外细胞感染模型并利用化学药物阻断宿主细胞内源性cAMP，利用共聚焦技术、免疫荧光并结合信号通路干扰技术系统研究分枝杆菌来源的cAMP介导宿主细胞自噬相关基因的表达情况，分析其如何通过干扰宿主细胞的cAMP信号通路调控细胞因子表达，进而干扰自噬信号抑制宿主细胞自噬体发生与成熟，从cAMP信号通路的角度阐释分枝杆菌来源的cAMP对宿主细胞自噬抑制的分子机理。

自噬是哺乳动物控制胞内感染的一种重要的免疫机制，结核分枝杆菌(M. tb)却能抑制这一过程，并且自噬抑制的发生与cAMP 水平增加相关。本研究中，我们利用BCG 作为模式菌，通过建立体外细胞感染模型并利用化学药物阻断宿主细胞内源性cAMP，利用共聚焦技术结合信号通路干扰技术系统研究分枝杆菌来源的cAMP 介导宿主细胞自噬相关基因的表达情况，分析其如何通过干扰宿主细胞的cAMP 信号通路调控细胞因子表达，进而干扰自噬信号抑制宿主细胞自噬体发生与成熟，从cAMP 信号通路的角度阐释了分枝杆菌来源的cAMP 对宿主细胞自噬抑制的分子机理。 . 我们利用同源重组型噬菌体构建腺苷酸环化酶敲除重组BCG，研究了不同腺苷酸环化酶对宿主细胞胞内cAMP增加的影响，并在此基础之上构建了双腺苷酸环化酶敲除重组BCG （GFP-ΔACs）。本课题从分枝杆菌来源的cAMP对宿主细胞的自噬、细胞因子的影响进行了研究。研究发现BCG对THP-1细胞株的自噬的干扰主要通过分枝杆菌来源的cAMP刺激蛋白激酶A (PKA)等信号转换器使cAMP反应元件结合蛋白CREB磷酸化；并且分枝杆菌来源的cAMP通过刺激宿主细胞增加CREB磷酸化，从而调节TNF-alpha水平显著增加（P<0.01）；通过敲除BCG腺苷酸环化酶，证实宿主细胞胞内增加的cAMP来源于BCG，并且敲除腺苷酸环化酶后随着胞内cAMP的降低CREB磷酸化水平、TNF-alpha水平也显著降低（P<0.01）；用TNF-alpha siRNA抑制TNF-alpha合成后，无论是腺苷酸环化酶敲除的重组BCG还是野生型BCG其自噬共定居水平均提高（P<0.01），证实分枝杆菌来源的cAMP通过CREB磷酸化调控TNF-alpha合成，进而影响自噬信号通路而抑制自噬发生。