渗透调节蛋白在乙烯刺激巴西橡胶树胶乳增产中的作用机制

Ethylene stimulation can significantly improve rubber production and has been widely used as a pivotal technology during the past decades in natural rubbertion industry all over the world, but the regulation mechanism is still unclear. Our comparative proteomics of rubber latex upon tapping and ethephon stimulation uncovered a specific protein named Osmotin. Its high expression was observed in virgin tree, and nearly disappeared after the first tapping, then almost recovered by ethephon treatment. But there was no obvious change of Osmotin expression in ethephon treatment upon virgin tree. Previous studies showed that the laticifer system turgor and osmotic adjustment is the basic factor for the discharge of latex, so we speculate that Osmotin may have effect on osmotic adjustment upon ethylene stimulated tapping process. It helps to maintain the stability of the latex to improve the latex yield. In this project, we aim to detect the expression of Osmotin in the ethylene sensitive and insensitive rubber tree latex to determine its ethylene response mode and its relationship with latex yield. Then, plan to determine the subcellular localization of Osmotin in laticiferous cell to definite its function place. At the same time, clone the Osmotin gene, transfer it to Arabidopsis thaliana to study its potential function. The results will help us to confirm the role of Hbosmotin in ethylene stimulated tapping process and find a breakpoint in mechanism study of ethylene stimulated tapping.

天然橡胶生产实践证实外施乙烯利能显著提高胶乳产量，但乙烯提高胶乳产量的机制仍不清楚。我们的前期工作分别对胶乳响应割胶和响应乙烯利处理进行了比较蛋白质组学研究，对获得的两组差异蛋白进行交叉比对，鉴定到一个变化极为显著的Osmotin蛋白。该蛋白在未开割橡胶树的胶乳中有一定的表达量，在割胶后极显著降低，在施用乙烯利后又显著提高到原有水平。我们推测Osmotin作为一种渗调蛋白，可能参与了橡胶树乳管系统的渗透调节，在乙烯刺激排胶的过程中可能通过维持胶乳的稳定性帮助延长流胶时间提高胶乳产量。本项目将首先确定Osmotin的乙烯响应表达模式及其与胶乳产量的关系；然后确定其在乳管细胞中的亚细胞定位，同时克隆该基因，转化拟南芥研究在渗透胁迫下该蛋白可能的生物学功能。研究结果将有助于阐明Osmotin在乙烯刺激割胶中的具体调控作用，为乙烯刺激割胶机制的研究找到新的突破点。

巴西橡胶树乳管细胞质胶乳是天然橡胶合成和储存场所。乙烯刺激很大程度上通过延长流胶时间来促进胶乳增产。我们从巴西橡胶树中鉴定到了一个渗透蛋白，并推测其在响应乙烯刺激排胶的过程中可能通过维持胶乳的稳定性帮助延长流胶时间提高胶乳产量。本项目从橡胶树中克隆了渗透调节蛋白基因HbOsmotin，转录产物长度为 1052 bp，开放阅读框为 792 bp，编码具有 264 个氨基酸和 27.7 kDa 的分子量的蛋白。氨基酸多重序列比对分析发现，HbOsmotin 具有在 N-末端附近的 22 aa 分泌信号肽， PR-5 蛋白形成 3D 结构的结构域序列和一个推测的在 C 末端附近的用于液泡定位的前肽。系统发生树分析发现HbOsmotin与杨树属的 PR-5 蛋白具有更接近的进化同源性。Southern杂交分析发现橡胶树中可能有两个拷贝或者橡胶基因组中可能存在 与HbOsmotin 的关系紧密的同源物。基因表达分析发现，未开割树中的机械伤害产生的HbOsmotin 表达水平变化不太明显；然而，在定期割胶的橡胶树中，割胶导致HbOsmotin 表达的急剧下降。同时，在定期割胶的橡胶树中通过乙烯处理可显着增加HbOsmotin 表达。蛋白表达分析发现HbOsmotin 蛋白在总胶乳或其不同组分中表达变化有限，HbOsmotin 蛋白被证实存在这种富含黄色体的胶乳组分中，HbOsmotin 蛋白含量在割胶后轻微降低，尽管割胶后 HbOsmotin 的减少但在乙烯利处理后几乎恢复到正常水平。HbOsmotin 的 mRNA 和蛋白水平在割胶和乙烯利处理之间不同; mRNA 水平的变化程度大于蛋白水平。在洋葱表皮细胞进行了HbOsmotin蛋白的亚细胞定位分析，发现HbOsmotin-GFP 荧光在细胞壁周围和在液泡内稍微累积，表明它也可以由细胞质分泌出去。在拟南芥HbOsmotin过表达株系中分析了HbOsmotin在响应渗透胁迫过程中的功能发现，过表达降低了种子在渗透胁迫下的发芽率和的存活率，也不能赋予对拟南芥中盐胁迫或盐胁迫敏感性的保护。以上研究结果基本阐明了HbOsmotin响应乙烯的表达模式，明确了其在乳管细胞中的定位，它赋予了过表达拟南芥植株可能高的细胞水势，参与调节乳管细胞中的渗透调节。研究结果将在乙烯刺激割胶的研究中找到新突破点，有助于揭示乙烯刺激割胶的机制。