上皮-间质转化和肿瘤干细胞特性在乙酰肝素酶促进胃癌侵袭、血管形成和转移中的作用及机制

Our previous studies have shown that heparanase enhanced the invasion，angiogenesis and metastasis of gastric cancer and heparanase-Src kinase-p38 kinase was a signal transduction pathway involved in the invasion，angiogenesi and metastasis of human gastric cancer cells. But the mechanisms of heparanase enhancing the invasion，angiogenesis and metastasis of gastric cancer aren't studied clearly. At present, some studies suggest that epithelial-mesenchymal transition and the characteristic of tumor stem cells play important action in the invasiveness, angiogenesis and metastasis of tumor, and are invovled in a lot of factors enhancing the invasiveness, angiogenesis and metastasis of tumor.So, we will investigate the effect and mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition and the characteristic of tumor stem cells in heparanase enhancing the invasion, angiogenesis and metastasis of gastric cancer by matrigel invasion assay of Transwell chamber, Wound-healing assay, angiogenesis in vitro assay, DNA recombinant gene, gene tranfection, RT-PCR, Western blot, flow cytometry selecting side population cells using fluorescent dye and testing and verifing the characteristic of tumor stem cells of side population through establishing subcutaneously transplanted tumor and metastatic tumor of abdominal cavity in nude mice.

前期 研究显示,乙酰肝素酶（HPA）促进胃癌侵袭、血管形成和转移,乙酰肝素酶-Src激酶-p38激酶可能是人胃癌细胞内存在的与侵袭、血管形成和转移有关信号转导通路，但乙酰肝素酶促进肿瘤侵袭、血管形成和转移的机制,还未研究清楚。目前研究显示,上皮一间质转化(EMT)和肿瘤干细胞特性获得在肿瘤侵袭、血管形成和转移过程中起重要作用,参与多种因子促进肿瘤侵袭、血管形成和转移的过程。为此,本研究将通过Transwell小室基质侵袭实验、划痕损伤实验、体外诱导血管生成试验、DNA重组构建基因和基因转染、RT-PCR、Western Blot、以及利用荧光染料,通过流式细胞术筛选侧群细胞（SP），并通过裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤建立等方法验证侧群细胞的肿瘤干细胞特性等方法,探讨EMT和肿瘤干细胞特性在乙酰肝素酶促进胃癌侵袭、血管形成和转移过程中的作用及机制。

我们前期研究显示，乙酰肝素酶促进胃癌侵袭、转移和诱导血管生成，但机制还未研究清楚，近年来研究发现，上皮-间质转化在肿瘤的侵袭、转移起重要作用，为此，本研究探讨了乙酰肝素酶是否促进人胃癌细胞发生上皮-间质转化,在这个过程中是否促进人胃癌细胞侵袭和转移和诱导血管生成。在本研究中，通过在人胃癌MGC803细胞和MKN28细胞细胞培养液中加入人乙酰肝素酶重组蛋白和将构建质粒pcDNA3.1-乙酰肝素酶转染入人胃癌MGC803细胞和MKN28细胞导致乙酰肝素酶高表达，我们观察到，乙酰肝素酶能诱导人胃癌细胞形态变得更梭形；乙酰肝素酶下调人胃癌细胞上皮标志物E．cadherin mRNA和蛋白表达，乙酰肝素酶上调人胃癌细胞间质标志物Vimentin和N．cadherin mRNA和蛋白表达；通过激光共聚焦显微镜，我们也观察到，乙酰肝素酶诱导人胃癌细胞间质标志物Vimentin的高表达；同时我们也观察到，乙酰肝素酶在诱导人胃癌细胞发生上述改变过程中，人胃癌细胞迁移能力、侵袭能力和诱导血管形成能力增强。在158例人胃癌组织，通过免疫组织化学染色方法检测到，乙酰肝素酶表达与上皮标志物E．cadherin表达成负相关关系(r=-0.76，p<0.05)，而与间质标志物Vimentin和N．cadherin蛋白表达呈正相关关系(r=0.87，p<0.05; r=0.80，p<0.05)，在人胃癌组织侵袭区域Vimentin和N．cadherin蛋白表达明显增强。这些研究结果显示，乙酰肝素酶可能诱导人胃癌细胞发生上皮-间质转化，并在这个过程中促进人胃癌细胞迁移、侵袭和诱导血管生成。通过本项目的研究，培养了两名硕士研究生，一名6月即将毕业，研究论文的题目初步拟定为《上皮-间质转化在乙酰肝素酶促进人胃癌细胞迁移、侵袭和诱导血管生成中的作用》，另一名明年即将毕业；在本校分子病理学实验室建立起探讨上皮-间质转化研究的实验平台；撰写了一篇综诉，已投稿，投在《临床与实验病理学杂志》，题目为《乙酰肝素酶促进肿瘤迁移、侵袭和诱导血管生成机制》，正在修稿；总结了一篇英文论著，正准备投入到SCI收录杂志。