酿酒酵母突变株耐受酸胁迫及高产谷胱甘肽的分子机制研究

谷胱甘肽（GSH）因其重要的生理活性获得广泛应用。近年来研究发现，酿酒酵母在多种胁迫压力下会促进GSH的合成，而外源添加GSH也有助于提高其对外界胁迫的抗性。但是对于其具体的分子机制目前了解还不透彻，进而成为限制代谢工程改造高产GSH菌株重要因素之一。本课题以自行筛选出的一株具有耐酸性的GSH高产菌株为研究材料，对于其耐酸性胁迫和高产GSH机制的两个关键问题进行研究。通过对GSH合成途径中关键酶编码基因的突变及其产物酶学性质的差异研究、酸胁迫下关键代谢途径酶活性以及生理指标的差异研究、基于高通量测序的转录组学研究及相关数据挖掘分析软件的分析，结合具体的生物化学、分子生物学、生理学信息，从多个层面阐述突变株耐受酸胁迫及GSH高产的分子机制和其中可能潜在的相互关联，为构建GSH高产工程菌提供可靠的依据。

项目背景.项目组前期通过复合诱变筛选出一株GSH产量显著提高的突变菌株Saccharomyces cerevisiae Y518。本项目在这一突变株所蕴含的特殊生物学意义基础上，研究相关突变基因编码蛋白的酶学性质，并揭示其导致谷胱甘肽过量合成的机制，为进一步构建高效的GSH生产菌株提供理论依据。.主要研究内容与结果和关键数据.（1）.GSH关键合成酶编码基因及活性研究.前期初步研究结果认为突变菌株中的GSH2基因突变可能是导致该突变株高产GSH的重要原因之一。通过反复对突变株与出发菌株谷胱甘肽合成酶基因GSH1和GSH2的克隆测序比较发现，突变株中GSH合成酶基因并没有发生突变，两个基因在大肠杆菌中的过量表达与酶活分析结果也没有表明其活性存在明显差异。但基因表达分析发现突变株中GSH合成关键酶GSH1的基因表达上调4.4倍。因此排除了原先的推论：在Y518中GSH合成酶编码基因的突变可能是导致GSH高产的原因。.（2）.基于RNA-seq的高产谷胱甘肽突变菌株转录组学研究；.对出发菌株与Y518发酵24h的全部转录本测序分析结果表明共有1628个基因表达具有显著差异（Fold change≥2.0并且FDR≤0.001）。相对于出发菌株，Y518全基因组中有1125个基因上调，503个基因下调。通过途径富集分析发现在这些上调的基因中，有1个(GSH1)富集在GSH合成通路，2个(MET17、CYS4)富集在半胱氨酸合成通路，4个(SUL1、SUL2、MET14、MET5)富集在硫吸收通路，还有4个(SKN7、SOD1、CTT1、GRX2)富集在氧化应激反应通路。转录组学结果提示突变株可能受到氧化胁迫。.（3）.突变株Y518相关酶及生理指标差异研究；.GSH合成相关酶活性显著高于出发菌，另外，与活性氧代谢相关的酶活力也显著增强，相关结果与转录组学结果高度吻合；内源性活性氧在Y518中显著增强；复合物I、II、III、IV活性分析表明Y518呼吸链存在缺陷；实验数据表明Y518细胞生长缓慢，相关代谢途径通量降低；.（4）.结合转录组学数据和生理学分析的Y518高产GSH机制研究与验证.复合物III的11个亚基编码基因测序分析表明其核心亚基Cor1发生Ala39Thr，Ser112Ala和Phe183Leu突变；验证实验证实Y518高产GSH的主要机制在于Comple