基于IRS/PI3K/Nrf2信号通路探讨参苓白术散对NAFLD氧化应激损伤的保护机制

Studies have shown that insulin resistance (IR) is a fundamental component of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); Oxidative stress is a key factor in the progression from simple fatty liver to non-alcoholic steatohepatitis ;IRS/PI3K/Nrf2 signaling pathway is an important way to connect IR and oxidative stress. Our previous study found that Shenling Baizhu Powder can significantly activate the endogenous antioxidant pathway of Nrf2/ARE in hepatic tissue and hepatocytes of NAFLD rats and exert the effect of lipid-lowering and liver-protection, but the specific mechanism is not clear. We propose a hypothesis: "Shenling Baizhu Powder may improve the body IR, alleviate the oxidative stress state of hepatocytes, clear the excess ROS and other oxidation products in the liver cells, maintain the hepatocytes lipid homeostasis through the regulation of IRS/PI3K/Nrf2 signal pathway". This project intends to use Gene Silencing, Flow Cytometry, RealTime Cellular Analysis, Western blot and other techniques to dynamically observe the effect of Shenling Baizhu Powder on the regulation of IRS/PI3K/Nrf2 signaling pathway and its downstream related genes and proteins in NAFLD rats in vitro and vivo. To elucidate the further mechanism of Shenling Baizhu Powder against oxidative stress and regulation of lipid metabolism in hepatocytes, and to provide a new experimental basis for prevention and treatment of NAFLD by Shenling Baizhu Powder.

研究表明，胰岛素抵抗（IR）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发生的基础环节；氧化应激是单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎进展的关键因素；IRS/PI3K/Nrf2信号通路是连接IR与氧化应激的重要途径。前期研究发现，参苓白术散能激活NAFLD大鼠肝组织Nrf2/ARE内源性抗氧化通路，发挥降脂保肝作用，但具体机制未明。提出假说：“参苓白术散可能通过调节IRS/PI3K/Nrf2信号通路，改善机体IR，缓解肝细胞氧化应激状态，清除过量ROS等氧化产物，维持肝细胞的脂质稳态”。本项目拟采用基因沉默、流式细胞术、实时无标记细胞分析、Western blot等技术，体内外动态研究参苓白术散对NAFLD大鼠IRS/PI3K/Nrf2信号通路及下游相关基因和蛋白的调控作用。阐明参苓白术散抗肝细胞氧化应激、调节脂质代谢紊乱的进一步作用机制，为参苓白术散防治NAFLD提供新的实验依据。

背景：IRS/PI3K/Nrf2信号通路是连接IR与氧化应激的重要途径，但具体机制未明。目的：本研究基于IRS/PI3K/Nrf2信号通路，研究参苓白术散通过Nrf2为核心的抗氧化基因以及Nrf2下游脂代谢相关基因对脂质代谢紊乱的调控作用，探讨参苓白术散对NAFLD氧化应激损伤的保护机制。方法与内容：①研究一：大鼠分组：正常对照组（NC）、高脂饮食（HFD）组和参苓白术散组（SLBZS）。②研究二：小鼠分组：野生型正常组（WT-N）、野生型模型组(WT-M)、参苓白术散+野生型模型组(WT-SL)、Nrf2敲除正常组（KO-N）、Nrf2敲除模型组（KO-M）和参苓白术散+Nrf2敲除模型组（KO-SL）。主要观察指标：①研究一：测量大鼠体重、肝湿重；肝组织HE和油红O染色观察病理改变；检测血清和肝组织生化指标； Western blot检测肝脏PI3K/Akt/Nrf2 信号通路蛋白表达。②研究二：检测小鼠体重、血脂、肝脂、血糖代谢和肝功能相关指标；检测氧化应激相关指标；全蛋白4D Lable-free定量蛋白组学检测肝脏蛋白谱的变化；转录组学检测肝脏基因表达谱的变化；广泛靶向脂质组学检测肝脏脂质成分的变化；Western blot检测肝脏多组学联合分析得出的核心蛋白表达。研究结果：①研究一：参苓白术散改善了NAFLD 大鼠血脂和肝脂异常，且PI3K/Akt/Nrf2信号通路及Nrf2下游抗氧化蛋白NQO1、GST和HO-1激活。表明参苓白术散通过激活IRS/PI3K/ Nrf2 信号通路抗NAFLD。②研究二：a) 参苓白术散具有改善NAFLD小鼠血脂、肝脂、血糖代谢和肝功能异常，减轻肝脏脂肪变性和脂质蓄积，改善了肝脏氧化应激状态等保护作用。Nrf2敲除减弱了参苓白术散对NAFLD小鼠糖脂代谢、肝功能、肝脏病理学异常以及氧化应激损伤的保护作用。b）参苓白术散缓解NAFLD 小鼠氧化应激状态和维持肝细胞的脂质稳态主要是通过调控Nrf2为核心的抗氧化基因及Nrf2下游脂代谢相关基因（Nrf2、Nqo1、HO-1、Gsta4、Cd36和Fabp4），进而调控下游各类脂质分子（FA、GP、ST、GL）。科学意义：本研究初步明确参苓白术散通过Nrf2为核心的抗氧化基因以及Nrf2下游脂代谢相关基因对脂质代谢紊乱的调控机理，初步揭示了参苓白术散防治NAFLD的现代科学内涵。