精子介导的HIV-1基因在胚胎细胞中表达调控机制的探讨—相关miRNA的筛选、鉴定与功能分析

分别从HIV/AIDS患者和正常男性取得精样，提取精子总RNA，利用基因芯片技术构建miRNA差异表达谱，经荧光实时定量PCR验证后，与"miRBase数据库"中的人、病毒miRNA进行比对，确定"表达差异显著的miRNA"所属类别，选择差异表达最显著的人、病毒miRNA各3个作靶miRNA。分别应用含靶miRNA模拟物和抑制剂模板序列的重组质粒，转染HIV/AIDS患者精子，再与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精，分别收集"模拟物组"和"抑制剂组"的２-细胞胚胎，应用免疫荧光和Wersten Blot技术检测HIV-1基因的蛋白表达；根据检测结果, 分析靶miRNA与HIV-1蛋白表达的关系，验证靶miRNA是否对HIV-1基因的表达起调控作用。本研究目的在于，揭示由患者精子带入受精卵中的HIV-1基因在胚胎细胞中表达调控的分子机制，为寻找药物靶标和开发miRNA抗病毒新疗法奠定基础。

目的：揭示由患者精子带入受精卵中的HIV-1基因在胚胎细胞中表达调控的分子机制，为进一步寻找药物设计的靶标和开发“miRNA抗病毒新疗法”奠定基础。材料和方法：募集已确诊的男性HIV/AIDS患者40例（病例组），健康男性自愿者20例（对照组）。在知情同意下，1. 按照世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册第5版标准，对其精样进行质量分析、膜功能和免疫功能检测。2. 使用TRIzol (Invitrogen) 和 miRNeasy 提取试剂盒（QIAGEN）分别提取病例组和对照组总RNA，经NanoDrop 1000鉴定总RNA完整性及质量，釆用miRCURY™ Hy3™/Hy5™ Power标记试剂盒对样品进行标记，在miRCURY™ LNA Array （v.16.0）芯片上进行杂交，经洗涤后，用Axon GenePix 4000B生物芯片扫描仪进行扫描。将扫描图导入Gene Pix 6.0 软件提取数据，并选择样本强度>50的miRNAs计算中位数标准化因子，用中位数标准化法计算miRNA的数值。以P值<0.05、倍数变化（fold change）值>2为条件来确定差异表达的miRNA；与“miRBase数据库”中的人、病毒miRNA进行比对，确定“表达差异显著的miRNA”所属类别，经实时荧光定量RT-PCR验证，筛选出靶miRNA进行后续研究。结果：1. 精子质量与功能分析：①HIV感染对人精液质量有显著影响并导致精子畸形率明显增高；②HIV/AIDS患者血液中CD4细胞计数、CD4细胞百分比明显降低、CD4/CD8值明显下降。2. miRNA差异表达分析：①成功地构建了病例组和对照组miRNA差异表达谱；差异表达的miRNA 中，72个表达水平上调，上调水平超过10倍的4个；81个表达水平下调，下调水平超过10倍15个。②比对结果表明，差异表达的miRNA全部为人源miRNA。③选择15个差异表达的miRNA用real time qPCR进行了验证。结果显示10个与芯片检测结果一致；其中表达水平上调5个（hsa-miR-107、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-92a-2-5p、hsa-miR-744-5p和hiv1-miR-H1）；表达水平下调5个（hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-1299、hsa-miR-221-5p、hs