‘鸭梨’SCF蛋白复合体组份功能解析

Generally speaking, Self-incompatibility(SI) is genetically controlled by a single polymorphic S locus, which harbors pistil S and pollen S determinant genes. The pollen S gene not only physically interact with pistil S gene, but also combine with SSK1 and CUL1 to form an SCF protein complex in Solanaceae and Plantaginaceae, and target at S-RNase destruction. However, it is unclear whether similar mechanism exist in Rosaceae (includes vast marjority of friut plants), which has a distant phylogenetic relationship with Solanaceae and Plantaginaceae, but they are blong to the same type of SI. The present study aims to: (1) clone the candidate pollen S gene by using YaLi as material, and confirm the existence of pollen S gene by transgene in Petunia; (2) isolate the orthologous genes of AhSSK1/PhSSK1 and CUL1 in Rosaceae by homologous cloning method; (3) identify the function of SSK1 by Southern blot, yeast two hybrid, protein pull-down and transgene; (4) verify the relationship among SSK1, SLF, CUL1, S-RNase in vitro by pull-down and yeast two hybrid. Finally, the mechanism of SCF complex in Rosaceae and its difference with Solanaceae and Plantaginaceae could be decerned. The present study will offer as new evidence in understanding the interspecific self-incompatibility in Rosaceae, as well as provide important theoretical basis for culturing friut in Rosaceae.

自交不亲和反应受控于花柱与花粉S基因。茄科和车前科自交不亲和反应中，花粉S基因产物除与S-RNase有物理互作外，还与SSK1及CUL1共同形成SCF蛋白复合体,但在与这两个科具较远亲缘关系且同属于S核酸酶类自交不亲和的蔷薇科中是怎样的至今无人研究。本项目拟以重要果树品种鸭梨为材料，克隆其候选花粉S基因，并通过转基因来确定其是否为花粉S基因；通过同源克隆法克隆SCF复合体组份的SSK1与CUL1，利用Southern杂交及RT-PCR来分析SCF复合体组份的表达模式，利用酵母双杂交、蛋白下拽来研究SCF复合体组份之间的相互作用关系，利用显性负效应的策略并通过转基因等方法研究SSK1基因的功能，最终探讨蔷薇科类自交不亲和反应中SCF复合体的作用机制及其与茄科和车前科的异同。预期结果对阐明蔷薇科自交不亲和性机理研究提供新的实验证明，也将为蔷薇科果树品种的选育奠定更充实的理论基础。

本研究主要是克隆梨中的SCFSLF（SSK1/CUL1/SLF）复合体的各个组份以及研究它们之间的相互作用关系。首先以白梨‘鸭梨’为材料，在其花粉cDAN中克隆得到了SCFSLF之一，即PbSLF，通过组织特异性表达研究发现，PbSLF基因是花粉特异表达的，利用‘鸭梨’和‘锦丰’杂交群体用来鉴定其与S-RNase连锁性发现，克隆到的PbSLF与S-RNase紧密连锁。同时，通过同源克隆，从苹果中也克隆得到了两个花粉特异表达的F-box基因，转基因实验证明其中有一个花粉S基因能够打破自交不亲和性。然后在梨花粉cDNA中克隆得到另外一个SCFSLF组份，即2个SSK1基因PbSSK1和PbSSK2，组织特异性表达实验发现它们均在花粉中特异表达，系统进化分析显示来自茄科、车前科和蔷薇科的SSK1-like基因在进化树上形成一个独立的进化枝，说明它们是一类进化上非常保守的基因。Southern杂交显示，SSK1基因在梨里有2个拷贝，在苹果中有3个SSK1的拷贝。此外，还从梨中克隆得到了SCFSLF复合体的第三组份，即一个花粉特异表达的PbCUL1基因，RT-PCR检测其组织特异性表达模式显示其在花粉里表达量较高，在花柱里表达较低，在叶片里没有表达。通过酵母双杂交和蛋白下拽实验研究了SCFSLF复合体组份之间的作用关系。实验显示梨的两个F-box均能与S-RNase直接相互作用。而两个PbSSK均能够与PbSLF和PbCUL1相互作用，即它们三者能形成一个SCFSLF复合体。以上结果暗示了白梨的SLF也通过与SSK和CUL1形成SCFSLF复合体来识别S-核酸酶。有意思的是，蛋白下拽实验显示在白梨和杂交矮牵牛两物种间SSK能与SLF和CUL1发生跨物种的相互作用。综合这些研究结果，我们认为SSK蛋白可能作为一类保守的花粉因子参与到S-核酸酶类型的自交不亲和反应中。同时，SCFSLF（SSK1/CUL1/SLF）复合体在茄科、车前科和蔷薇科物种的保守性存在暗示了这三个科在S-核酸酶类型自交不亲和反应中可能具有相似的分子和生化机制。