蛋白酶体双抑制剂治疗三阴性乳腺癌的设计、生物测试及作用机制研究

There are no effective methods for the treatment of maligant triple negative breast cancer (TNBC) in clinic. Recent studies indicated that the breast cancer cells were more sensitive to the inhibitors of proteasome β5 subunit by inhibiting the activity of β2 subunit, which means that β2 and β5 dual inhibitors may be beneficial for the treatment of triple negative breast cancer (TNBC). We obtained a highly active and selective β5 inhibitor Y459 with the support of National Natural Science Foundation of China for young scholars (No.21302097). Virtual screening of NCI compound library and biological investigation led to a highly selective β2 lead compound NFU-8 with moderate activity. After optimization, more active NFU-23 was obtained. The cell cycle arrests of Y459 and NFU-23 on MDA-MB-231 and effects of Y459 on the apoptosis of related genes were finished. In this application, we plan to optimize the NFU-23 to get a more selective and active β2 inhibitor and then combine Y459 to investigate the best reaction time and concentration ratio to inhibit the TNBC cell line MDA-MB-231. Based on these results, the combination index (CI) will be calculated and the effects of the dual inhibitors with best concentration ratio on the cell cycle and apoptosis rate will be investigated by using the flow cytometry. Finally, the proteins associated with the apoptosis and cell cycle, such as p53, caspase3, PARP, p21, CDK, JNK and the transcription factor Nrf1 will be analyzed by western blot technologies, which may reveal the mechanism leading to the TNBC.

恶性的三阴性乳腺癌目前无有效治疗手段。最近研究指出，抑制蛋白酶体β2亚基的活性将增加乳腺癌细胞对β5亚基抑制剂的敏感性。因此针对β2和β5亚基的双抑制剂可能对治疗三阴性乳腺癌有效。申请人在青年基金资助下筛选出对β5亚基活性和选择性较好的抑制剂Y459。虚拟筛选NCI化合物库又获得了对β2亚基有一定活性和选择性的化合物NFU-8，结构优化后获得了活性更好的NFU-23。已完成了Y459和NFU-23分别阻滞三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞周期及Y459对凋亡相关蛋白影响的研究。本申请拟进一步对NFU-23进行结构优化，获得活性和选择性更高的β2抑制剂后与Y459作为双抑制剂联用，考察不同浓度比及不同时间抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的联合用药指数CI。采用流式细胞及western blot技术检测双抑制剂对细胞凋亡、周期分布及相关凋亡蛋白的影响，研究乳腺癌可能的发病机制。

三阴性乳腺癌是一种恶性肿瘤，目前仍然是医学界难以攻克的难题。三阴性乳腺癌占乳腺癌病理类型的20%，由于其预后较差，目前除了化疗手段外，没有任何有效的靶向药物用于该疾病的治疗。在真核细胞中, 90％功能异常的蛋白质降解都是通过泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）来完成。如在肿瘤细胞中，过度表达的蛋白酶体会降解抑癌基因p53、p27等，导致肿瘤细胞出现指数增长。因此通过抑制蛋白酶体活性，阻断抑癌因子被降解来抑制肿瘤细胞生长并促进肿瘤细胞凋亡，为开发新的抗肿瘤药物提供了思路。研究发现，如果同时抑制蛋白酶体的β1和β2亚基活性，将会增加三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231对β5亚基抑制剂（如硼替佐米和卡非佐米）的敏感性，这种双抑制剂有可能用于治疗三阴性乳腺癌。本研究最初以课题组筛选出的对β5亚基活性和选择性较好的抑制剂Y459为基础进行结构优化，得到成药性更好的Y219（目前已到II期临床）。但是对β2亚基抑制剂NFU-23进行结构优化后，其活性并没有显著提高，可能是由于NFU-23的母核结构限制了该方向的发展。将Y219和NFU-23联用对抑制三阴性乳腺癌效果并不理想，说明通过目前的抑制剂联用无法达到预期目的。随后申请人进行了方向调整，通过调研文献发现，蛋白酶体抑制剂和核输出抑制剂均能通过对NFκB通路的抑制产生抗肿瘤效果，因此，两种药物在作用机制上可能存在潜在的协同作用。于是我们大胆尝试，选择蛋白酶体抑制剂Y219和核输出抑制剂KPT-330联合使用，考察联合使用对三阴性乳腺癌的治疗效果。结果表明：（1）体内外结果显示Y219和KPT330两药联用可以协同治疗三阴性乳腺癌；（2）药物联用导致抑癌因子cyclinB1, p21, p27和p53等上调及诱导caspase-3, caspase-8, caspase-9和PARP的活化切割增加；（3）NF-κB信号通路解释了协同作用机制：Y219抑制了IκB-α被降解而KPT-330阻止了IκB-α出核，进而抑制了细胞核中NF-κB通路的活性。以上为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的方向与思路。