非ATP竞争抑制/非变构抑制的新结构AKT共价抑制剂的设计合成及靶向治疗三阴性乳腺癌的分子机制

AKT is a main effect kinase in PI3K signaling pathway, recent studies found that AKT activation in many breast cancers, especially in triple negative breast cancer. Although there are many types of small-molecule inhibitors of AKT is reported, but most are still in preclinical and first or second stage clinical studies. In previous studies, our group found that a dithiodiketopiperazine class natural products can be selective covalent binding to Akt Cys310 residues, suppresses the Ser308 phosphorylation and ATP-binding, and induction of apoptosis and autophagic cell death in TNBC cells. This project will be based on the structure of Akt, using the Chetmoin active fragment combined with asymmetric synthesis method of building an entirely new structure non-ATP competitive lead compounds covalent inhibitors of Akt, and in depth study on its biological activities on the basis of the system through structure-activity relationship studies, structural modifications to these lead compounds and transformation, with a view to eventually achieve high activity and selectivity of the covalent inhibitors of Akt drug candidates. Moreover, the project will perform the investigation of drug-ability of drug candidates and discovering the molecular mechanism of induced apoptosis and autophagic cell death in TNBC cell lines, to lay the foundation for further studying the novel protein kinase inhibitors with non-ATP competitive and non-allosteric inhibition in TNBC targeted therapeutics.

AKT是PI3K信号通路中主要的效应激酶，近年来研究发现AKT在多种乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌中异常激活。虽然目前已有多种小分子AKT抑制剂报道，但大部分处于临床前和一二期临床研究阶段。申请人在前期研究中发现一种硫代二酮哌嗪类天然产物Chetomin的新作用机制：选择性共价结合到AKT的Cys310残基，抑制Ser308磷酸化和ATP结合，并诱导TNBC细胞凋亡和自噬性死亡。本项目将基于AKT的结构，利用Chetmoin活性片段结合不对称合成方法构建全新结构的非ATP竞争性AKT共价抑制剂先导化合物，并在系统研究其生物活性的基础上，通过构效关系研究，对这些先导化合物进行结构修饰和改造，以期最终获得高活性和高选择性的Akt共价抑制剂候选药物。并深入考察候选药物的成药性及其诱导TNBC细胞程序性死亡的分子机制，为进一步研究该类非ATP竞争性抑制和非变构抑制的TNBC靶向治疗药物打下基础。

近年来许多研究发现以Akt为核心组成部分的多条信号通路在肿瘤的发生发展及药物耐药中起到一定的作用，其可能成为靶向治疗新的靶点。Akt抑制剂可能成为肿瘤靶向药物开发的一个新的方向。临床样本分析以及组织样本免疫组化分析证实高度激活的Akt1是一种潜在的肿瘤治疗靶标。经过系列化合物的设计合成、体外酶活实验和MTT比色法发现化合物18u的体外抗肿瘤活性最佳，其对Akt1的IC50为34nM，对Huh-7细胞的IC50为76nM；分子对接结果显示化合物18u可稳定结合在Akt1蛋白的ATP结合口袋。（2）Annexin V-FITC/PI双染法中证实了化合物18u具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；磷酸钙法构建的稳定表达GFP-LC3的肿瘤细胞经18u处理后，可明显观察到荧光聚集点；透射电镜观察18u处理过的细胞可观察到凋亡和自噬发生的典型特征；（3）Western blot验证细胞凋亡和自噬相关经典蛋白表达情况，18u可诱导Cyto.C表达上调，抗凋亡因子Bcl-2表达下调，caspase-3分子降解水平增高；LC3-I向LC3-II的转换增多，自噬小体形成相关蛋白Beclin-1表达水平明显上调，同时与自噬降解关系密切的蛋白p62/SQSTM1表达亦上调。（4）Western blot检测Akt/mTOR信号通路蛋白表达情况，Akt1，mTOR和GSK3β磷酸化水平下调，呈剂量依赖性，而总Akt1，mTOR和GSK3β表达水平未见明显变化。（5）免疫荧光观察腺病毒质粒mCherry-GFP-LC3转染的细胞，18u处理组呈现出自噬体的黄色荧光，Baf-A1抑制自噬可以增加18u诱导的自噬体的形成。（6）自噬抑制剂3-MA或Baf-A1可以分别减少和增加18u对细胞增殖的抑制作用。（7）体内动物实验表明18u能够显著减少肿瘤体积及重量；免疫组化结果显示，化合物18u对肿瘤组织Akt的表达水平无明显影响，但可以显著抑制肿瘤组织中p-Akt（Ser473）的表达，同时能够显著降低肿瘤组织中增殖相关标记物Ki-67的表达，升高自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达，此外TUNEL 凋亡检测提示18u在组织水平可以诱导肿瘤细胞凋亡的发生。研究结果表明Akt1可能是一种有效的肿瘤治疗靶标，化合物18u这种新型Akt1抑制剂的分子机制值得进一步研究，并具有成药潜力，可能是一种有前景的候选药物。