含氯化酶基因放线菌的筛选和农用新活性化合物的研究

从微生物代谢产物获得独特高活性样品化合物并结合先进的农药靶分子筛选模型是进行农药先导化合物筛选和创制微生物农药的有效途径。含氯天然产物具有结构多样性和高活性特性。本项目以放线菌氯化酶基因的保守序列设计引物，以基因组DNA为模板PCR扩增，产物经变性梯度凝胶电泳分析，测序，获得含氯化酶基因非重复菌株；单重、多重诱变激活放线菌菌株并测定与基因簇激活有关的rpsL、rsmG及rpoB基因的突变且RT-PCR验证激活菌株氯化酶基因转录；提取激活菌株发酵产物为配体，利用本实验室构建的杀虫、除草等靶分子筛选模型进行亲和筛选，纯化亲和筛选的活性化合物并结构解析。这一高灵敏的筛选方法与获得新活性化合物独特的技术相结合，可高效发现含氯高活性化合物和微生物农药，从而加快新农药创制。本研究提出的研究思路与方法具有创新性，是发现农药活性化合物新的、有效的技术，对新农药创制具有重要的实际应用价值。

微生物次级代谢产物是天然产物药物的重要源泉，氯化化合物具有结构的多样性和高的生物活性，可以为微生物新农药的创制提供先导化合物结构。本研究采用不同的分离策略从植物内生环境和土壤环境中共分离得到75株放线菌，其中34株放线菌对枯草芽孢杆菌或藤黄微球菌表现出拮抗作用，18株放线菌对8种农作物病原致病真菌（黄瓜褐斑病原菌、黄瓜炭疽病原菌、大豆菌核病原菌、番茄早疫病原菌、水稻纹枯病原菌、大豆疫霉病原菌、辣椒疫霉病原菌、马铃薯晚疫病原菌）中的2种病原菌具有一定的拮抗作用。经多相分类学研究，其中1株菌株被鉴定为野野村氏菌属的一个新种，被命名为Nonomuraea solani（菌株保藏号为CGMCC 4.7037和DSM 45729），1株菌株被鉴定为小单孢科的一个新属菌种，命名为Xiangella phaseoli（菌株保藏号为CGMCC 4.7038和DSM 45730）。经沉默基因激活和OSMAC发酵，从3株放线菌中共分离得到5个已知化合物和12个新化合物，并展现出较好的抗癌活性或抗作物病原菌活性。其中，氯化化合物雷莫拉宁A2组分对革兰氏阳性细菌具有极强抑菌活性，PTMs类化合物对表皮葡萄菌Staphylococcus epidrmidis或白色念珠菌Canidia albicans、水稻纹枯病原菌Rhizoctorzia solani展现出良好的抑菌活性， Borrelidin对防治大豆疫病有特效，其抑制大豆疫霉Phytophthora sojae的EC50和EC95分别为0.0056μg/ml和0.026μg/ml，是现有商品化药剂甲霜灵EC50值的1/62.5倍和EC95值的1/263.5倍，是现今报道的杀菌活性最高的化合物，盆栽实验结果显示Borrelidin在浓度为10mg/L时对大豆疫霉的防效达到了94.72%，高于同等有效剂量的25%甲霜灵可湿性粉剂。对Borrelidin抑制大豆疫霉病原菌的机理进行了研究，结果表明Borrelidin通过与苏氨酰-tRNA合成酶的结合而阻断蛋白质的生物合成，进而抑制菌丝的生长。通过现代光谱学技术研究了氯原子对氯化染料木素与血清白蛋白之间相互作用的影响，表明氯原子，特别是3'位氯原子可增强氯化染料木素与牛血清白蛋白的结合。这些研究不仅为微生物药物提供了丰富的菌种资源和先导化合物结构，而且为防治大豆疫霉病的发生提供了新的方法，此