鸭绿江滨海湿地放线菌多样性及农用活性化合物资源的发掘

The littoral wetland along the Yalu River，located on the north end of the coastline in China， is the zone of a complex and diversified ecosystem which is composed of reed marsh, tidal marsh, seepweed marsh, estuarine marsh and so on.As the best-known resting place for migrators in northeast Asia, the coastal wetland has abundant biodiversity, and it is especially rich in special actinomyces.Firstly, the project will collect samples from the northen littoral wetland with consideration of the ecotype, tidal patterns and salt gradient, to establish the approach of actinomyces isolation and purification, which can lead to the culture of various actinomyces and the analysis of the diversity and distribution of cultivable ones.Secondly, with the adoption of PCR-DGGE and T-RFLPs, biological genome DNA of all the samples will be taken as model to do analysis of the diversity and distribution of the culture-free actinomyces.Lastly, targeting at the Melons fusarium oxysporium and tabacco mosaic virus seriously detrimental to agricultural production, the activity of the wetland actinobacteria will be evaluated through the analysis of the specific genes, after they are screened first by means of the cyclinder plate method and leaf disc method and then of the pot cultivation experiment. Besides, the agricultural active compound resources will be explored with the aid of modern analystic technology of isolation and purification. The research is aimed to reveal the relationship between the constitution of actinomyces population and environmental factors, which will enrich the actinomyces resources of our country and explore new types of the agricultural active compound.

鸭绿江滨海湿地处于我国海岸线最北端，湿地内形成了芦苇沼泽、碱蓬盐沼、潮沼、河口湾和浅海海域等复杂多样的生态系统，为东北亚最重要的鸟类迁徙停歇地，具有丰富的生物多样性，孕育着独特的放线菌资源。本项目首先根据北方滨海湿地的生态类型、潮汐规律及盐分梯度规律采集样品,建立湿地放线菌分离纯化方法，获得各种放线菌纯培养，分析可培养放线菌多样性及其生态分布特点。同时以各样品中的生物基因组总DNA为模板，采用PCR-DGGE和T-RFLPs技术，分析免培养放线菌多样性及其生态分布特点；最后，以农业生产上危害严重的瓜类枯萎病菌和烟草花叶病毒为靶目标，通过特定基因分析，结合菌碟法和叶碟法初筛，盆栽试验复筛，进行湿地放线菌活性评价；同时借助现代分离纯化和分析技术，进行农用活性化合物资源发掘。研究结果对揭示北方滨海湿地放线菌种群结构与环境因素间的关系，丰富我国放线菌资源并从中发掘新型农用活性化合物具有重要意义。

鸭绿江滨海湿地是我国北方具有重要代表性的湿地类型，该湿地地势宽阔，生态系统复杂多样，微生物多样性十分丰富，孕育着独特的放线菌资源。湿地微生物在湿地物质循环、能量流动等方面起着重要作用，并在发掘各种重要活性化合物方面具有重要意义。因此，研究鸭绿江滨海湿地微生物多样性，阐明湿地微生物种群变化与环境因素之间的关系，特别是放线菌种群多样性及其与环境因素之间的关系，对开发和利用鸭绿江滨海湿地放线菌资源具有重要理论和应用意义。.项目执行期间，根据鸭绿江滨海湿地不同生态类型先后共采集135份样本。采用高通量测序技术对鸭绿江滨海湿地5种生态型样品的微生物多样性进行分析发现，5种生态型样品中微生物基因序列归属于30个门288属，其中放线菌有23个属。样品盐度、有机质和总氮含量较高时，样品中的微生物多样性相对丰富。采用不同分离方法和分离培养基，共获得232株放线菌，归属于放线菌目的18个属，并发现2株潜在新种。以G-和G+细菌和枯萎病菌、辣椒疫霉等为指示菌，筛选获得55株具有抗菌活性的菌株。利用单因素和响应曲面法实验，优化了菌株C318、S202、6-1、HW80的发酵条件，优化后的菌株抗菌活性提高了1.17~2.13倍。研究发现，12株真菌与放线菌共培养可显著提高放线菌菌株12.6%~90.1%的抑菌活性；对菌株MY02和GQ-17诱导机制初步研究表明，真菌多糖是诱导放线菌菌株活性增加的主要因素。采用GC/MS对菌株HW80挥发性代谢产物分析表明，其挥发性代谢产物中含有50种化合物，其中醇类12种，芳香类化合物7种，烷烃类20种，醛酸类3种。研究中还发现，灰平链霉菌菌株S501在深层液体发酵和固态发酵条件下分别具有产内切和外切菊粉酶能力，优化条件后产酶活性分别可达121.6U/mL和186.4U/g；纯化后的外切菊粉酶分子量为23.442KDa，以氨丙基凝胶为载体，戊二醛固定，酶活可达164.2U/mg。为进一步从基因水平分析菌株S501产活性化合物能力，通过lluminaHiSeq PE150测序平台获得该菌基因组长度为7，395，673 bp，包含了6533个蛋白编码基因，预测到PKS－I／II／III型、NRPS和萜烯类生物合成基因簇等30个，具有较好的开发潜力。项目研究结果对建立并利用鸭绿江滨海湿地放线菌资源，挖掘放线菌活性代谢产物以及开发微生物农用生态产品奠定了重要基础。