Clp蛋白酶系统参与叶绿素降解代谢关键酶蛋白降解的机制研究

Mature leaves can swiftly yet reversibly initiate senescence in responding to the changes of internal and/or external factors, with the degradation or re-biosynthesis of chlorophyll (Chl) as being the most significant molecular phenotype; and the swiftness of the response is vital to the survivability of plants. However, little is known about the underlying mechanisms. Over the last decade or so, the major biochemical pathway of Chl degradation has been largely revealed by identifying Chl catabolic genes (CCGs), and substantial progress made in elucidating the regulatory mechanisms of their transcription. However, the regulation of the protein abundance of Chl catabolic enzymes (CCEs) is seldom explored. Recently, we found that NYE1 protein could be rapidly degraded in response to the changes of environmental or developmental signals, but the molecular mechanism underlying is not clear. In this project, we plan to investigate the following issues: 1) to analyze the degradation characteristics of NYE1 protein and identify the related protease of NYE1 protein, 2) to elucidate the molecular mechanism by which the candidate Clp protease degrades NYE1, and 3) to explore the possible involvement of Clp protease in catalyzing the degradation of other major CCEs. By doing these, we expect to understand more about the complex/multi-layered/precise regulatory mechanisms of Chl degradation during leaf senescence. At the same time, we also expect to reveal more diverse functions of Clp protease in modulating plant growth and development.

叶片发育成熟后会响应体内外相应因子的变化可逆地启动衰老褪绿进程，这一灵敏的响应能力对于植物灵活地调整其生存策略至关重要，然而其中的分子机制依然知之甚少。编码叶绿素降解关键代谢酶（CCEs）的基因（CCGs）已经先后被克隆；在转录水平上，以NYE1为代表的CCGs的表达受到严格调控；然而，CCEs在蛋白水平上的调控机制却鲜有探索。前期分析表明，NYE1蛋白能够响应环境或发育相关因子的变化而快速合成或降解；本项目拟通过解析NYE1蛋白的降解特性并鉴别相关降解酶，阐明候选Clp蛋白酶降解NYE1的分子机制，探索Clp蛋白酶参与其它CCEs降解的可能性，系统阐明主要CCEs的降解机制。预期结果不仅有助于理解叶绿素降解的多层级精准调控机制，也有助于理解衰老进程中叶绿体内降解代谢酶蛋白的降解机理；通过探索Clp蛋白酶参与CCEs蛋白的降解机制，还有助于阐明Clp蛋白酶在植物生长发育过程中的多样性功能。

叶片发育成熟后会响应体内外相应因子的变化可逆地启动衰老褪绿进程，这一灵敏的响应能力对于植物灵活地调整其生存策略至关重要，然而其中的分子机制依然知之甚少。编码叶绿素降解关键代谢酶（CCEs）的基因（CCGs）已经先后被克隆；在转录水平上，CCGs的表达受到严格调控；然而，CCEs在蛋白水平上的调控机制却鲜有探索。本项目第一部分研究了光环境调控以NYE1蛋白为代表的叶绿素降解代谢酶蛋白的合成与降解。研究发现，在未衰老叶片中CCGs的表达存在显著的波动，而这种波动与光-暗交替显著相关，与CCA1介导的节律信号没有明显相关性；在叶片自然衰老过程中，CCGs剧烈上调表达，并且CCEs蛋白逐渐累积；在叶片黑暗诱导衰老过程中，NYE1蛋白大量合成积累，而放回正常光照条件下叶片中的NYE1蛋白会被降解，并且提取的NYE1蛋白在体外光照处理条件下更易降解；光照处理下NYE1蛋白加速降解与产生的活性氧（ROS）显著相关；在叶片中诱导过表达NYE1后，光照处理时叶片产生大量单线态氧（1O2）。本项目第二部分在蛋白水平阐明了Clp蛋白酶复合体参与降解NYE1蛋白的分子机制。研究发现，NYE1蛋白在叶绿体内被蛋白降解系统所降解，丝氨酸蛋白酶抑制剂能够部分抑制NYE1蛋白的降解；利用亲和纯化-质谱联用技术筛选到与NYE1蛋白相互作用且定位于叶绿体内的候选Clp蛋白酶复合体；Clp蛋白酶复合体负责底物识别的亚基能够与NYE1蛋白相互作用；当Clp蛋白酶复合体负责底物识别的CLPC1亚基功能缺失时，NYE1蛋白的降解就被显著抑制。在此基础上，顺利完成了本项目研究的总体目标，即解析以NYE1蛋白为代表的叶绿素降解代谢酶CCEs蛋白的降解机制。本项目的研究结果有助于理解叶绿素降解的多层级精准调控机制，也有助于理解衰老进程中叶绿体内降解代谢酶蛋白的降解机理，还有助于阐明Clp蛋白酶在植物生长发育过程中的多样性功能。