Zfx基因控制人造血干细胞自我更新的作用机制及其应用研究

体外大量扩增造血干细胞并满足临床治疗需要是目前国内外研究的热点之一。我们前期研究发现：Zfx基因仅在人造血干细胞高表达，且具有促进造血干细胞克隆增殖作用，提示Zfx参与造血干细胞自我更新的调控；采用TAT-Zfx融合蛋白导入小鼠造血干细胞，体外大量扩增造血干细胞获得成功，扩增后细胞仍然保持造血干细胞的特征（Biochem Biophys Res Commun. 2009;379(3):771-4）。但机制不清，本课题拟通过研究Zfx基因对人造血干细胞分化、凋亡及衰老等方面的影响，分析其中的相关因素，阐明Zfx在控制人造血干细胞自我更新中的作用机制，结论将有助于进一步了解人造血干细胞的生物学特征和调控机制，为体外可调控的大量扩增人造血干细胞提供充分的理论依据；同时我们期望在前期研究基础上，实现造血干细胞体外扩增后动物移植模型的建立和研究，为将来该项技术可能的临床应用提供理论基础和实验依据。

背景：X连锁锌指蛋白基因（ZFX）是一种ZFY家族锌指蛋白，它与Y连锁锌指蛋白基因在结构上相似，它主要负责形成性别控制信号。2007年人们发现ZFX能调控胚胎干细胞和造血干细胞的自我更新；随后研究表明，ZFX是胚胎干细胞和造血干细胞分化过程中的重要转录调节因子，在许多恶性疾病中，ZFX基因的表达水平与疾病的恶性程度和严重性密切相关，例如前列腺癌，乳腺癌和神经胶质瘤。然而，ZFX在急性白血病中的作用仍不清楚，并且由于急性淋巴细胞性白血病细胞株通常都表达CD34阳性，即具有造血干细胞的特征。因此，研究人员以急性淋巴细胞性白血病细胞为研究对象，研究ZFX在急性白血病中的作用及其可能的分子机制，以期寻找ZFX调控细胞自我更新的可能分子机制。.方法：采用分子克隆技术，从急性淋巴细胞性白血病患者原代细胞中克隆出ZFX基因，并通过基因测序验证；通过Real-Time PCR技术检测儿童急性淋巴细胞性白血病骨髓单个核细胞中ZFX表达，并与临床预后结合分析，了解不同表达水平与预后之间的相关性；慢病毒包装的GFP-ZFX-siRNA抑制急性淋巴细胞白血病细胞株REH细胞中ZFX基因的表达，并用流式细胞术检测不同干扰序列干扰下，含有GFP的细胞比例的变化，分析干扰后细胞增殖能力的变化，运用CCK-8技术检测白血病细胞增殖抑制情况；运用半固体血清培养技术，了解干扰后细胞克隆形成能力的变化；通过RT-PCR技术、流式细胞术和蛋白质印迹等方法检测干扰后REH细胞的细胞周期和凋亡、ZFX mRNA及ZFX蛋白表达变化情况，明确干扰效果和凋亡发生；运用基因芯片技术检测ZFX靶基因干扰后，相关基因的表达情况并通过实时定量PCR验证，寻找可能的调控通路。.结果：与正常对照组相比，急性淋巴细胞性白血病患者白血病细胞中ZFX表达显著增高，且ZFX高表达的患者预后较差；通过慢病毒包装的ZFX-siRNA抑制急性淋巴细胞性白血病细胞株REH中ZFX表达并确定有两条siRNA干扰序列可使ZFX基因表达下调；并且发现ZFX的表达下调能抑制白血病细胞增殖和克隆形成，并诱导REH白血病细胞的凋亡；基因芯片技术显示这一过程可能是通过细胞因子受体交互通路上调FASLG来完成。.结论：研究结果提示ZFX高表达与白血病预后负相关；ZFX敲除后可抑制白血病细胞生长，这主要是通过促进细胞凋亡来实现的。