牛肝细胞SNAT2经mTOR-S6K信号通路调控氨基酸分配的分子机制研究

Low milk protein content is a major issue for producers in China, so analysis of milk protein precursor amino acid distribution regulation pathway is of practical significance as a means to improve milk protein production. Using real-time PCR, western blot, RNA interference, high performance liquid chromatography and radio-immunity technology, we will study the effect of neutral amino acid transporter 2 (SNTA2) on distribution of amino acids, explore SNAT2 regulated targets involved into the change rule in the process of amino acid distribution in hepatocytes of cows by analyzing the key genes and proteins, and investigate the molecular mechanism of SNTA2 regulating intrahepatic distribution of amino acids in mTOR/S6K pathway. These results will further elucidate the regulation mechanisms of amino acid transporter via mTOR/S6K signal pathway origin from liver, and thus provide a basis for developing the effective way to improve milk quality, milk protein content, and milk protein production.

牛乳中乳蛋白含量较低是中国乳品行业所面临的重要问题，立足于中国的现状，通过分析乳蛋白前体物质氨基酸的分配调控途径提高乳蛋白含量与产量将有现实意义。本项目将在前期研究的基础上，通过荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、RNA干扰、高效液相色谱、放射免疫等方法，研究肝细胞中性氨基酸转运载体2（SNAT2）对氨基酸分配的影响，探寻SNAT2表达调控肝细胞内氨基酸分配的关键基因和蛋白变化规律的靶点，探讨SNAT2经mTOR/S6K信号通路影响肝内氨基酸分配的生化调控机制。阐明mTOR/S6K通路在SNAT2影响肝内氨基酸分配的分子机理。研究结果将深入阐明起源于肝脏的氨基酸转运载体经mTOR/S6K信号途径对氨基酸分配的调控作用，为更深入研究乳品质控制、提高乳蛋白含量和乳蛋白产量的有效途径提供科学理论依据。

牛乳中乳蛋白含量较低是中国乳品行业所面临的重要问题，立足于中国的现状，通过分析乳蛋白前体物质氨基酸的分配调控途径提高乳蛋白含量与产量将有现实意义。通过奶牛动物实验结果显示高精料饲喂显著提高了氨基酸转运载体SNAT2蛋白的表达，促进氨基酸进入肝脏用于合成总蛋白、球蛋白。氨基酸在肝脏内被过多消耗，降低了血液中氨基酸的流量，可能会直接影响了肝脏可分配乳腺利用的氨基酸。为了验证乳腺可利用的氨基酸在肝脏中重分配，体外肝细胞被分离培养并通过不同氨基酸处理，结果显示亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸处理在低浓度条件下可显著提高原代奶牛肝细胞增殖活性，具有浓度依赖性，浓度优势范围在0.5-3.0 mmol/L范围。亮氨酸、组氨酸及两者混合氨基酸处理24h后，Phe、Ser、Gln、Gly、Asn、Arg、Glu和Lys的含量减少，其中Arg的含量显著降低（P<0.05）。蛋白分析结果显示亮氨酸、组氨酸及两者混合氨基酸处理氨基酸转运载体SNAT2 蛋白表达均上调，其中混合处理显著上调。对mTOR信号通路分析加过显示当亮氨酸添加浓度为0.5-3.0 mmol/L时，mTOR基因的表达显著升高（P<0.01)，亮氨酸添加浓度为3.0 mmol/L时，表达量达到最高。另外，mTOR信号通路下游基因S6K1、4EBP1、eEF2、RS6 和 EIF4E的表达显著上调。沉默和过表达SNAT2质粒均构建完成并质粒转染肝细胞结果显示，蛋氨酸和组氨酸最佳浓度处理下，相比于沉默组和NC组，过表达SNAT2组中的mTOR、S6K、EIF4EBP1、EIF4EBP2、EEF1和EEF2蛋白表达水平显著上调。