鹌鹑Leptin基因经JAK-STAT信号通路调控采食的分子机制研究

Leptin is a protein secreted primarily by white adipose tissue and has multiple physiological actions including food intake, energy homeostasis, growth，development and reproduction. Since it was first reported that the so-called “chicken leptin gene” was cloned from chicken liver in 1998, the correctness of the sequence of chicken leptin gene and even the beingness of the gene in poultry were plagued by controversy. In 2014, there were three independent laboratories who reported the cloning and functional verification of leptin gene in some wild birds, which pushed the research of avian leptin and leptin receptor to a new climax. Both the molecular structure and expression pattern of Leptin in birds are totally different to another vertebrates，and the mechanism underlying its physiological function remain unclear.Recently, our group obtained part nucleotide sequence of quail leptin gene and 4 different alternative splicing isoforms of LEPR. In the current study, we will firstly clone authentic intact quail leptin gene and express recombinant protein, then investiage effect of Leptin on orexia regulatory factors from peripheral tissue and CNS in JAK-STAT signal pathway in quail by means of intracerebroventricular injection, qRT-PCR, gene microarray and NMR metabonomics analysis. The objective is to elucidate its functional mechanism of Leptin regulating appetite in quail, and lay the foundation for further research of the functional mechanism in bird.

Leptin是参与食欲调控、能量平衡和繁殖等生理活动过程的多功能细胞因子。自1998年首次报道从鸡肝脏中克隆“鸡Leptin基因”以来，其正确性以及禽类Leptin的存在性就一直备受争议。2014年，三个独立实验室先后报道了部分野生禽类Leptin基因的克隆和活性检测，禽类Leptin的研究又被推向新高潮。禽类Leptin基因分子结构和表达模式都与其他脊椎动物相去甚远，其生理功能和调控机制尚不明确。本课题组克隆了鹌鹑的部分Leptin序列及其受体的4种剪切亚型。以此为基础，本项目将克隆完整的鹌鹑Leptin基因，表达重组蛋白，通过脑室注射、实时定量PCR、表达谱基因芯片、代谢组学分析结合体外实验系统研究Leptin对外周组织和中枢神经系统食欲调控信号分子和JAK-STAT信号通路的影响，阐明其调控机制，为进一步完善家禽Leptin的生理功能及调控机制奠定基础。

在哺乳动物中Leptin是参与食欲调控、能量平衡和繁殖等生理活动的多功能细胞因子。2014年，野生鸟类Leptin基因成功克隆，部分回答了禽类中是否存在Leptin基因这一长久困扰禽类Leptin研究的问题。到目前为止，家禽中的重要物种鸡和鸭均只获得了部分Leptin编码序列。近期研究表明禽类Leptin基因分子结构和表达模式都与其他脊椎动物相去甚远，其生理功能和调控机制与哺乳动物也存在一定差异。本研究基于公开数据库序列搜索和分析，对鹌鹑Leptin基因进行克隆和结构分析，并对其组织表达模式进行研究；以3周龄朝鲜龙城母鹌鹑为研究对象，对其进行禁食和禁食后恢复采食处理，分析不同处理条件下促食欲基因、抑食基因以及Leptin/LEPR的差异表达情况，探究Leptin/LEPR与鹌鹑采食调控的关系。以3周龄（未开产）和20周龄（高产期）的朝鲜龙城黄羽母鹌鹑为研究对象，对其性腺轴上的繁殖相关基因及Leptin/LEPR在两个发育阶段的表达差异进行检测，探究Leptin/LEPR与鹌鹑繁殖调控的关系。主要结论如下： .1、获得长度为675bp的鹌鹑Leptin序列，超过已经公布的鸡和鸭leptin序列完整度（鸡596bp，鸭504bp）；.2、由于GC含量过高，采用5’Race PCR技术不能够扩增出鹌鹑Leptin 5’端外显子4及之前的核苷酸序列；构建了鹌鹑基因组Hind-Ⅲ BAC文库，挑选含有Leptin片段的阳性克隆，通过三代测序仍无法获得Leptin序列全长；.3、鹌鹑Leptin和LEPR呈广泛性组织表达。鹌鹑Leptin在骨骼肌、胰腺和下丘脑中表达相对较高，而LEPR在垂体中极高表达，提示Leptin/LEPR在鹌鹑的脑部能量平衡的控制、繁殖调控以及肌肉发育方面扮演重要角色。鹌鹑Leptin/LEPR在肝脏和脂肪组织中低表达，表明鹌鹑Leptin不是一个脂肪依赖性分泌的激素。.4、缺少前导肽的重组鹌鹑第4外显子蛋白，不能引起绿色荧光蛋白向细胞核迁移，不能激活JAK-STAT通路。.5、鹌鹑Leptin可能并不作为抑食因子参与鹌鹑的食欲调控，但是能够激活性腺轴，抑制卵泡发育。.该项目在高GC含量的Leptin基因鉴定方面做了大量探索性工作，为进一步深入开展禽类Leptin基因鉴定和功能研究奠定了基础。