Fstl1在肝纤维化以及Antrodin B抑制活化的肝星状细胞分泌胞外基质中的分子作用机制

Liver fibrosis is an active process that involves changes in cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Hepatic stellate cells (HSCs) play an essential role in the development of liver fibrosis. Follistatin-like 1 (Fstl1) is a secreted follistatin-module containing glycoprotein with many biological functions. This proposal is motivated by previous work from the evidence that Fstl1 is overexpressed in liver fibrosis and upregulated in activated hepatic stellate cells (aHSCs) and from the evidence that Antrodin B, a compound isolated from Antrodia camphorata in submerged culture significantly inhibits both ECM production and Fstl1 expression in aHSCs. To investigate the cellular and molecular pathways and biologic role of Fstl1 engaged in liver fibrosis as well as whether Antrodin B prevents aHSCs from secreting ECM by targeting Fstl1，we are going to use morphological, immunohistochemistry analysis, cell biology， molecular biology techniques and Fstl1 mutant mice to analyze the effect of Fstl1 downregulation or overexpression on TGFβ and PDGF signaling in vitro in aHSCs models and in vivo in a mouse model of CCl4-induced liver fibrosis. The study will provide a new perspective to find a therapeutic target and effective interventions in the treatment of liver fibrosis.

肝纤维化的形成涉及到细胞-细胞和细胞-胞外基质（ECM）之间的一系列复杂的反应。肝星状细胞（HSC）在此过程中起着关键性作用。Fstl1属于Fst-SPARC家族成员，是有着重要生理功能的胞外小分子糖蛋白，我们前期工作发现其在肝纤维化和活化的HSC中高表达，还发现从樟芝液态发酵提取得到的化合物Antrodin B在活化的HSC中抑制ECM生成的同时抑制了Fstl1的表达。本课题拟从体外活化HSC模型及体内CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，利用Fstl1突变体小鼠，运用形态学、免疫组织化学、细胞生物学及分子生物学等技术手段研究Fstl1下调或过表达后对TGFβ和PDGF信号通路的影响，探索肝纤维化过程中Fstl1的生理功能及细胞分子机制以及研究Antrodin B是否通过干预Fstl1从而抑制HSC分泌ECM。研究将为寻找肝纤维化的治疗靶点及有效药物干预措施提供新的视角。

肝纤维化是指由慢性炎症导致的肝组织结构变化及大量纤维瘢痕的形成，进一步可发展为肝硬化及肝癌，目前无有效药物。目前研究证实肝星状细胞（HSCs）的活化是肝纤维化发生的重要环节。卵泡抑素样蛋白1（Follistatin-like protein 1，Fstl1)是分泌到胞外的糖蛋白，具有多种生物学功能，但其在肝纤维化中的表达和作用还有待考察。.本研究利用四氯化碳CCL4诱导小鼠肝纤维化模型，应用荧光定量PCR和蛋白质印迹等方法检测Fstl1及肝纤维化相关基因的表达。结果表明Fstl1在肝纤维化进程中表达量持续上调。利用Fstl1creER；Rosa-tomata-GFP小鼠，通过他莫昔芬的诱导下进行Fstl1 表达细胞的谱系追踪，结果表明Fstl1在正常肝脏中表达量很低，CCL4诱导肝纤维化后其表达增多。结合免疫荧光染色发现Fstl1与HSC活化标记蛋白a-平滑肌肌动蛋白a-SMA共定位。进而利用Fstl1敲除杂合子小鼠Fstl1+/-研究Fstl1在体内对于肝纤维化进程的作用。CCL4损伤后Fstl1+/-小鼠肝组织中Fstl1, a-SMA及胶原含量的表达比其野生型对照组要低。以上结果表明Fstl1在HSC活化与分化以及肝纤维化过程中起关键的作用。在TGF-β1诱导活化的肝星状细胞CFSC-8B模型上，TGF-β1可剂量及时间依赖性的上调Fstl1基因及蛋白的表达；Fstl1中和性抗体可抑制TGF-β1诱导的α-SMA基因及蛋白水平的表达，并下调Collagen1和Fibronectin基因的表达；Fstl1蛋白可以增强TGF-β1诱导的α-SMA和Col1的表达。 该结果表明Fstl1可增强TGF-β1诱导的肝星状细胞活化及胞外基质沉积，封闭其作用可下调纤维化相关基因的表达。以上结果表明Fstl1可能成为未来治疗肝纤维化的新靶点。.此外，本研究建立了快速简便的肝纤维化体外细胞筛选模型，并以活性为导向从樟芝发酵菌粉中分离得到具有抗肝纤维化活性的单体化合物Antrodin B，并揭示Antrodin B可抑制Fstl1, TGF-β1及PDGF-BB诱导的细胞增殖、细胞活化、细胞迁移及胞外基质沉积，其机制可能与负调控PDGF-BB/MAPK和TGF-β1/Smad2/3信号通路有关，Antrodin B可作为潜在的治疗肝纤维化的药物分子进一步研究。