肝细胞SIRT1抑制肝纤维化过程中肝星状细胞活化的分子机制研究

Liver fibrosis is the abnormal accumulation of extracellular matrix, and liver cell damage is the initiating factor in the occurrence of liver fibrosis. Under the state of liver injury, hepatic stellate cells (HSC) activation is a central event in hepatic fibrosis. In previous study, we found that in liver cell-specific SIRT1 knockout mice, CCl4 injury increased pro- fibrosis-related factors TGF-β1 levels and reactive oxygen species (ROS) activity, severe liver damage, HSC activation proportion and the degree of fibrosis was significantly higher than WT control group. However, how SIRT1 function in the process of liver injury, and thus influence fibrosis is unknown. We have known that TGF-β1 is a major factor promoting HSC activation, oxidative stress is an important motivation of HSC activation and liver damage, so we hypothesized that in case of liver damage, specific knockout of SIRT1 in hepatocyte promotes HSC activation microenvironment through regulating TGF- β1 and ROS, thereby promoting fibrosis. This study aimed to investigate the influence of level changes of SIRT1 in liver cells on activation of HSC, clarify regulation mode of SIRT1 in the liver cells on TGF-β1 and ROS, revealing a bridge function of SIRT1between hepatocyte damage and activation of hepatic stellate cells.

肝纤维化为肝脏细胞外基质的异常堆积，肝细胞受损是肝纤维化发生的始动因素。肝损伤状态下，肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化的中心事件。我们前期发现，肝细胞特异性SIRT1基因敲除小鼠在CCl4损伤模型中，促纤维化相关因子TGF-β1水平增高，反应性氧族（ROS）活性增强，肝功受损严重，HSC活化比例以及纤维化程度明显增高。而SIRT1如何在肝损伤过程中发挥功能，并进而影响纤维化却不得而知。已知TGF-β1是促HSC活化的主要因子，氧化应激是肝损伤及HSC活化的重要动因，因此我们推测，肝脏在损伤情况下，SIRT1在肝细胞中特异性敲除会通过上调TGF-β1和ROS水平形成更易HSC活化的微环境，从而促进肝纤维化。本研究旨在探讨肝细胞中SIRT1水平改变对HSC活化的影响，阐明SIRT1在肝细胞中对TGF-β1和ROS的调控模式，揭示SIRT1在肝细胞损伤与肝星状细胞活化之间的桥梁作用。

肝脏纤维化是一个以细胞外基质蛋白(EMC)沉积为特点的损伤修复过程，在各种肝损伤因子刺激下，受损的肝细胞释放多种细胞因子，激活Kuffer细胞、白细胞，分泌的过氧化物及炎症因子共同作用于肝星状细胞(HSCs)，使之活化并合成分泌大量细胞外基质。SIRT1是一种NAD+依赖型组蛋白去乙酰化酶，在衰老、DNA损伤、炎症、肿瘤、尤其肝脏脂质代谢中发挥重要作用，但是SIRT1在肝脏纤维化中的作用及其机制尚不清楚。本研究通过利用SIRT1肝脏特异性敲除小鼠建立CCL4诱导的肝纤维化模型，观察SIRT1对肝纤维化进程的影响并深入研究其可能的调控机制。. 本研究采用的大致研究方法为10%CCl4或溶剂橄榄油腹腔注射6-8周肝脏特异性敲除SIRT1（SIRT1-LKO）小鼠及同窝野生小鼠，每周2次，连续8周。于第八周收集各组小鼠肝脏、血清标本，HE染色及Masson染色评估小鼠肝纤维化病变的程度，比较小鼠肝脏生化指标及胆汁酸含量。采用基于HepG 2-LX 2细胞共培养体系的体外实验探究SIRT1、胆汁酸、IQGAP1在HSCs活化中的调控机制。. HE染色及Masson染色显示在CCL4诱导下，与同窝野生小鼠相比，SIRT1-LKO小鼠肝纤维化模型组纤维化程度加重，且ALT、AST均升高，而胆汁酸水平则有所下降。RT-PCR显示在CCL4诱导下SIRT-LKO小鼠中α-SMA及Collagen 1A1 mRNA表达明显高于野生小鼠。用不同浓度鹅去氧胆酸或去氧胆酸处理人肝星状细胞（LX2细胞），其IQGAP1呈剂量依赖式升高，而α-SMA表达下降。SIRT1过表达HepG2细胞-LX2共培养体系或SIRT1过表达细胞条件培养基处理LX2细胞后，LX2细胞中IQGAP1表达明显升高，而α-SMA表达下降。. 通过以上结果可得出以下结论：1.SIRT1在调节肝脏纤维化进程中发挥重要的保护作用；2.SIRT1通过调节肝细胞的胆汁酸代谢影响肝星状细胞中IQGAP1的表达，从而调控HSCs的活化。