红球菌Y22菌株降解尼古丁的代谢途径和分子基础研究

尼古丁是烟草重要的成瘾物质，也是烟草生产废弃物中主要的有害物质，对人体呼吸系统和交感神经具有潜在的危害。我国是全球最大的烟草生产和消费国，随着国际《烟草控制框架公约》的实施，"降害"成为中式卷烟发展的关键。申请人已筛选获得一株以尼古丁为唯一碳氮源生长的高效降解菌红球菌Y22菌株（Rhodococcus sp. Y22），并分离得到一个新的尼古丁代谢中间产物。本申请项目拟以该菌株为研究对象，继续分离鉴定尼古丁降解的其它代谢产物，阐明红球菌降解尼古丁的代谢途径；利用DNA步移技术和筛选基因组文库等方法克隆尼古丁降解基因，通过异源表达对基因的功能进行鉴定，揭示红球菌降解尼古丁的分子基础；通过对红球菌处理烟叶的作用条件研究，确定其降解尼古丁的最佳条件。该研究可为揭示烟草中尼古丁的生物降解和转化提供重要理论基础；同时新的尼古丁降解基因和途径的发掘将会为生产实践提供理论依据。

本项目以前期筛选得到的尼古丁降解细菌红球菌Y22（Rhodococcus sp. Y22）为出发菌株，用HPLC和TLC方法对红球菌Y22烟碱代谢产物进行检测和分析，并用柱层析和制备型TLC方法对烟碱的代谢产物进行分离。对分离出的产物I用NMR、EI-MS和UV光谱进行鉴定，产物II用NMR、EI-MS、UV光谱和傅里叶变换红外光谱进行鉴定。经鉴定产物I为6-羟基烟碱，产物II为5-(3-Methyl-[1,3]oxazinan-2-ylidene)-5H-pyridin-2-one。产物III为烟碱蓝。同时，红球菌Y22的烟碱诱导型休止细胞可以有效地降解烟叶中的烟碱，但降解过程受水分含量的影响较大。此外，毒理学实验结果说明，红球菌Y22能显著降低卷烟烟气细胞毒性的作用和对染色体损伤的遗传毒性作用以上。综上，红球菌Y22能有效降解烟叶中的烟碱，在烟叶的降焦减害和加速醇化过程中具有潜在的应用价值。. 使用兼并引物扩增得到Y22菌株的尼古丁脱氢酶（NDH）编码基因的保守序列，再通过染色体步移技术扩增得到保守序列两端的序列。Y22菌株NDH编码基因大小为3613 bp，该基因由大亚基/中亚基和小亚基三个亚基组成。其中大亚基包含2247个碱基，中亚基包含888个碱基，小亚基包含486个碱基。使用半定量RT-PCR技术检测NDH大亚基编码基因表达量，在烟碱诱导的条件下，该基因的表达量逐渐增加，6 h大亚基的表达量是2 h的1.8倍；而在非诱导条件下，随着菌株的生长NDH编码基因大亚基的表达量逐渐下降， 6 h时表达量为零，说明NDH参与了烟碱的降解。. 通过本项目的研究，鉴定了红球菌降解尼古丁的部分代谢产物，初步推测其代谢尼古丁的途径，并扩增得到NDH的编码基因序列，基于RT-PCR结果推测NDH参与尼古丁的降解。部分研究成果在PLoS One、Applied Microbiology and Biotechnology和烟草科技上等核心刊物上发表，部分研究成果还在进一步整理和投稿。项目执行期间，发表7篇论文，其中SCI源刊论文6篇，获得国家发明专利授权2项，培养4名研究生获得学位。本项目的主要研究成果分别荣获2010年云南中烟工业有限责任公司科技进步一等奖和2012年云南省科技进步三等奖。综上，本项目顺利完成了预期的研究内容和目标。