利用启动子陷阱转座子技术鉴定和克隆家蚕组织特异型启动子

启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。本项目拟创制一种能够捕获启动子的启动子陷阱家蚕；另一种是能够提供转座酶、帮助启动子陷阱转座子在家蚕体内随机转座的转座酶家蚕。通过这两种家蚕的杂交，使启动子陷阱转座子和转座酶同处一条家蚕体内。再经HSP70启动子诱导表达转座酶，帮助启动子陷阱转座子在家蚕基因组内随机转座，获得大批插入家蚕启动子下游、且阅读框保持可读状态、组织特异性表达EGFP基因的家蚕个体，利用DNA片段删除法分析和获得家蚕组织特异型启动子。本项目采用以简单养蚕方法替代高难度的显微注射方法，获得大量转基因家蚕突变体，解决了家蚕利用"启动子陷阱转座子"技术过程中的关键问题。项目成果能够提供多个新的家蚕组织特异型启动子，同时由启动子陷阱转座子插入家蚕功能基因区域而形成的大量家蚕突变体资源，可进一步用于家蚕基因功能的规模化研究。

启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。为了正确地利用启动子陷阱转座子技术克隆家蚕组织特异型启动子，我们首先采用蛋白质组研究策略分析了丝腺、血液、精巢、卵巢等组织器官的特异性蛋白质表达情况，采用表达谱芯片技术分析了丝腺的特异性mRNA表达情况, 采用solexa测序结合miRNA芯片技术分析了特异性miRNA表达情况，以获取组织特异性启动子的信息。我们构建了4种不同转座子臂长的质粒，通过转染昆虫BmN细胞、应用流式细胞仪测定GFP阳性细胞比率、以及转基因家蚕实验，分析获得了转座效率最佳的转座子臂长。构建了2种能够捕获启动子的启动子陷阱家蚕、能够提供转座酶并帮助启动子陷阱转座子在家蚕体内随机转座的转座酶家蚕，通过这两种家蚕的杂交试验，证明经HSP70启动子诱导表达的转座酶活性较低，表达活性与其他转基因家蚕表达外源蛋白的活性相近。为了提高捕获启动子的能力，我们在启动子陷阱转座子质粒构建中导入了内部核糖体进入位点序列，成功捕获了启动子。采用这种技术，获得大批插入家蚕启动子下游、且阅读框保持可读状态、组织特异性表达EGFP基因的家蚕个体，已利用DNA片段删除法技术分析获得了丝腺、中肠、皮肤等多种家蚕组织特异型启动子。由启动子陷阱转座子插入家蚕功能基因区域而形成的大量家蚕突变体资源，可进一步用于家蚕基因功能的规模化研究。     .研究结果已发表论文7篇，其中SCI论文5篇。获2项发明专利。毕业博士研究生4人，硕士研究生2人。已完成研究任务，达到项目预期目标。