甘蓝型油菜组织特异型启动子的分离与鉴定

甘蓝型油菜是我国最重要的油料作物之一，对其抗性和光合效率等性状进行基因工程改良，可促进我国南方冬闲田油菜的发展，保障食用油的供给安全。组织特异型启动子能驱动外源基因在特定组织器官中高效表达，对作物品质改良，提高抗性和产量等方面具有重要作用。项目前期分析了甘蓝型油菜和拟南芥基因表达谱，筛选了油菜根、茎秆、叶片和角果皮特异表达基因各1个，获得了基因的启动子序列。后续研究将利用RT-PCR检测基因在油菜中的组织特异性；5′RACE定位基因的转录起始位点；构建promoter-GUS载体转化甘蓝型油菜，明确启动子在油菜基因工程中的作用；以启动子缺失载体转化拟南芥确定组织特异表达的核心序列；凝胶阻滞实验和启动子点突变载体的瞬时表达鉴定顺式元件的位置与功能。研究结果有助于深入理解甘蓝型油菜中启动子调控基因转录的调控机制及组织特异表达的本质，对油菜及近缘物种基因工程改良具有重要的理论意义和实践意义。

甘蓝型油菜是我国最重要的油料作物之一，对其抗性和光合效率等性状进行基因工程改良，可促进我国南方冬闲田油菜的发展，保障食用油的供给安全。组织特异型启动子能驱动外源基因在特定组织器官中高效表达，对作物品质改良，提高抗性和产量等方面具有重要作用。项目利用拟南芥、白菜和甘蓝基因表达谱数据进行了深入的生物信息学分析，筛选了48个组织特异表达候选基因，其中叶、根和茎特异表达基因分别为7个、4个和10个，蕾和花特异表达基因各4个，角果皮和种皮特异表达基因分别为6个和2个，种子特异表达基因5个，根茎叶特异表达基因6个。根据白菜和甘蓝中特异表达基因保守序列设计了实时定量PCR检测引物，以分析基因在甘蓝型油菜中油821 DH系10个组织器官（根、子叶、下胚轴、茎干、叶片、蕾、花、角果皮、花后15和45天种子）中的表达模式。检测结果共获得了单一组织器官中特异表达的基因12个及两个以上组织器官中特异表达的基因11个。扩增片段测序结果证实了扩增条带来自候选基因。5′RACE扩增明确了特异表达基因转录起始位点位于起始密码子ATG上游26-175 bp处。启动子克隆结果表明启动子长度分别为1300-2396 bp，与甘蓝型油菜基因组序列一致性为98.0%-100%，表明我们已成功获得这些基因的上游启动子序列。利用酶切连接构建上述启动子的promoter-GUS载体，测序鉴定后转化农杆菌感受态获得转基因工程菌株。利用农杆菌介导转化油菜下胚轴的方法，我们获得了种子特异表达基因BnCDD、花特异表达基因BnHABF和叶片特异表达基因BnMAPK10的promoter-GUS载体T2代纯合转基因植株，其他载体也正在通过农杆菌介导转化和浸花法转化甘蓝型油菜以继续研究这些基因启动子的功能。转基因阳性植株GUS染色结果表明，BnCDD、BnHABF和BnMAPK10基因启动子分别在种子、花和叶片中具有GUS活性，证实了这些启动子为不同组织器官的特异启动子。顺式调节元件分析表明4个种子特异表达基因启动子均存在胚乳表达的Skn-1_motif，而BnCAMS1启动子中还存在胚乳表达的GCN4_motif，提示启动子中的组织特异表达顺式调节元件可能参与其表达模式调节。本研究获得的组织特异启动子将为我国油菜基因工程改良提供具有自主知识产权的组织特异启动子资源，对油菜及近缘物种的基因功能研究和基因工程育种具有重要意义。