鳗弧菌SIP催化胞内铁释放的分子基础研究

Iron is an essential element for the survival of marine bacteria. To adapt to low-iron surroundings and uptake enough iron, marine bacteria have evolved an endogenous siderophore-mediated iron acquisition system. When bound to siderophores, iron will be actively transported into cytoplasm and released from the siderophores to be assimilated by the cell. In the process of iron release, the siderophore-interacting protein (SIP) acts as a key enzyme. However, very few studies have focused on the SIP catalytic iron release in Vibrio anguillarum and many scientific questions remain unanswered. In this project, we take the SIP from V. anguillarum 775 (Va.SIP) as the research object. Using X-ray crystallography, molecular microbiology and biochemistry methods, we are going to clarify the catalytic characteristics of Va.SIP, analyze its crystal structure, reveal the relationship between the active site residues of Va.SIP and its catalytic function, and elucidate importance of the iron release to the low-iron surrounding adaptability of this species. This research would be conducive to understanding molecular mechanism of iron release in V. anguillarum, and fill the gap in the iron acquisition research. And it would provide a scientific basis for further investigating adaptability of V. anguillarum to the low-iron surroundings, which is of referential significance for studies on the environmental adaptability of other marine bacteria as well.

铁是海洋细菌生存的必需元素。为了适应低铁环境并获取足够的铁，海洋细菌进化出内源铁载体介导的铁获取系统。当铁载体结合了环境三价铁后，会被细菌主动运输至胞内，铁继而从铁载体释放下来才能被细胞所利用。在铁释放的过程中，铁载体相互作用蛋白（SIP）发挥了关键的催化作用。然而，鳗弧菌SIP催化铁释放的相关研究目前几近空白，很多科学问题尚没有得到解释。本项目将以模式鳗弧菌775来源的SIP（Va.SIP）为研究对象，综合利用X射线晶体学、分子微生物学和生物化学等手段，明确Va.SIP的催化特点，解析Va.SIP蛋白的晶体结构，揭示Va.SIP活性位点残基与催化功能的关系，并阐明SIP催化铁释放对菌体适应低铁环境的重要性。这一研究不仅将有助于理解鳗弧菌铁释放过程的分子机制，丰富鳗弧菌铁获取系统的理论，同时还将为探讨鳗弧菌的低铁环境适应性提供科学依据，这对其它海洋细菌的环境适应性研究同样具有借鉴意义。

弧菌是海洋常见的一类病原性细菌。为适应低铁环境并获取足够的铁，弧菌进化出铁载体介导的铁获取系统，该系统主要涉及铁载体的合成、分泌、铁摄取和铁释放四个环节。目前弧菌铁载体的合成、分泌及铁摄取过程已得到广泛研究，然而铁释放环节仍不清楚，分子基础有待阐明。本项目主要围绕鳗弧菌催化胞内铁释放的分子基础开展蛋白结构及功能研究。首次解析了鳗弧菌铁载体相互作用蛋白SIP（Va.SIP）的晶体结构，这是弧菌类首个SIP蛋白结构。结构显示，Va.SIP具有两个结构域，其中N端结构域稳定结合了一个FAD分子，其互作方式与SIP家族其它成员相似；C端结构域在末端形成了一个α-螺旋，其构成了底物结合口袋的重要元件。结构比对分析显示，Va.SIP底物结合口袋包含三个赖氨酸残基形成的底物识别位点。这三个赖氨酸残基侧链均指向口袋内部，但不清晰的侧链电子密度显示口袋在结合底物前表现出一定的柔性。序列保守性分析表明，这些赖氨酸残基在多数弧菌种类的SIP中高度保守，提示它们对这类弧菌SIP的底物识别功能不可或缺。然而Va.SIP的底物结合残基却与霍乱弧菌同源蛋白ViuB存在显著差异，在霍乱弧菌ViuB中，相应的三个底物结合残基分别是赖氨酸-组氨酸-精氨酸，意味着ViuB在底物识别特性上有别于Va.SIP。系统发生分析显示，Va.SIP与霍乱弧菌ViuB分别位于弧菌SIP的两个进化分枝，在各自分枝内，底物结合残基都表现出高度的保守，因而这些底物结合残基可用作弧菌SIP划分为两类的重要标记。底物结合残基差异的鉴定，不仅为理解弧菌胞内的铁释放环节奠定分子基础，还为阐明弧菌SIP家族的分类提供关键信息。鉴于Va.SIP的独特性，本项目进一步分析了va.sip基因对菌体生长和鱼苗侵染的作用。结果显示Va.SIP功能失活对鳗弧菌生长和毒力未产生明显的抑制影响。结合前期研究基础，我们提出该基因失活后对菌体影响较小与鳗弧菌可能存在其它未知的铁释放途径有关。