基于冷胁迫诱导下相容性溶质胞内积累的鳗弧菌活疫苗冻干耐受分子机制

Vaccination is the key supporting technologies for the health and sustainable development of aquaculture.Research and development of vairous new type aquatic vaccines are being developed at an unprecedented rate.The development is based on understanding of molecular mechanisms of vaccine.This will enable design and development of the vaccine is more reasonable and scientific.Freeze-drying as an important production mode of aquatic live vaccine and R & Dcontent is facing many challenges.Freeze-drying tolerance and stability of vaccine cell is one of the most prominent one of the challenges.Accumulation of compatible solutes is a strategy widely employed by bacteria to achieve cellular protection against environmental stresses.Bacteria use compatible solutes to protect their cytoplasmic biomolecules against cold stress.Much studies have revealed that the preferred compatible solutes for the majority of bacteria are betaine, ectoine and trehalose.In this study, the we will aim at identifying the compatible solutes biosynthesis and uptake relevant functional genes in Vibrio anguillarum,and find the mechaisms of accumulation of the compatible solutes in cell agansit cold stress. Based on this mechaism, we will establish regulation mechanism for freeze-drying tolerance of live Vibrio anguillarum vaccine by accumulation of compatible solutes,and to provide a new optimization strategy for the development of more stable freeze-dried live Vibrio anguillarum vaccine.

接种疫苗是水产养殖业健康可持续发展的关键支撑技术。各种新型水产疫苗的研究和开发正以前所未有的速度发展着。这些发展是以对疫苗的各种分子机制的了解为基础的，这将使得疫苗的研发设计更具合理性和科学性。冻干剂型作为水产活疫苗的重要产品形式和研发内容面临着许多挑战，疫苗细胞的冻干耐受稳定性是其中最为突出的挑战之一。积累相容性溶质是细菌普遍采用的一种应对环境胁迫的细胞保护策略。积累合适的相容性溶质可为微生物细胞在低温胁迫下提供有效地保护。对大多数微生物较为有效的相容性溶质为海藻糖、甜菜碱和四氢嘧啶等。本研究以海洋鱼类鳗弧菌活疫苗为研究对象，旨在发现存在于鳗弧菌中的相容性溶质生物合成和摄取相关功能基因，阐明相容性溶质胞内积累的冷胁迫响应机制，并以此分子机制为基础，建立起基于相容性溶质胞内积累下的鳗弧菌活疫苗冻干耐受保护策略，为开发鳗弧菌活疫苗冻干剂型提供全新的优化策略提供理论支持。

接种疫苗是水产养殖病害非常有效的防控策略，活疫苗可同时激发体液和细胞免疫，相比灭活疫苗具有更好的免疫效力。冷冻干燥是目前活疫苗最为广泛采用的产品制备技术，而冷冻和脱水干燥等加工过程胁迫显著影响了鳗弧菌冻干疫苗的细胞存活率，已经成为制约其进一步生产开发与应用的主要瓶颈问题。通过胞内积累相容性溶质抵御不利环境胁迫（如低温、干燥和高渗压等）是细菌普遍采用的细胞保护策略。目前，鳗弧菌中是否存在这种抵御环境胁迫的遗传机制及能否建立基于此机制的活疫苗冻干保护策略未被揭示。本课题针对这些问题开展鳗弧菌活疫苗冻干耐受机制的研究。. 在完成鳗弧菌疫苗株基因组测序及生物信息学分析的基础上，我们发现并鉴定了鳗弧菌中存在甜菜碱和四氢嘧啶两种相容性溶质合成系统（分别由betABI和ectABC基因簇编码）及转运系统，其中四氢嘧啶转运系统是由proVWX基因簇编码的三磷酸腺苷结合盒转运蛋白，而甜菜碱转运系统似乎存在冗余特征。两种溶质的胞内积累（合成或摄取）均受环境冷胁迫的正向调控，甜菜碱的合成必须依赖前体物质胆碱，而四氢嘧啶则可从头合成，它们的胞内积累均可有效抵御冷胁迫对细胞生长的抑制影响，其中四氢嘧啶胞内积累的冷胁迫响应机制为首次在海洋弧菌种属中被证实。此外，甜菜碱和四氢嘧啶胞内积累的冷胁迫调控在转录水平表现出生长阶段依赖特征（分别为对数期和平衡期）。本研究还发现甜菜碱的合成积累会显著抑制四氢嘧啶的合成与转运，预示着鳗弧菌优先积累甜菜碱响应低温胁迫，而四氢嘧啶的胞内积累则作为应对环境营养匮乏时的救援性策略发挥作用。同时转运积累优先于合成积累。. 基于上述揭示的相容性溶质胞内积累的冷胁迫响应机制，我们通过培养过程中或冻干制剂配苗阶段实现相容性溶质在疫苗株的胞内积累，建立起胞内外冷冻保护剂的协同保护，有效改善了鳗弧菌活疫苗冻干耐受性，显著提高了细胞存活率和细胞活力，为今后开发稳定的鱼用活疫苗提供了一种新的冻干产品设计策略和应用基础支持。