马缨杜鹃类黄酮3-O-糖基转移酶调控其花色形成的机理研究

Flower color formation and its regulation mechanism is the most studied secondary metabolic pathway in ornamental plant. But the anthocyanin mechanism of Rhododendron has been extended to other ornamental plants, particularly lily and chrysanthemum. Moreover, the study on anthocyanin mechanism and its regulation of Rhododendron is still in its infancy, and the related molecular information is very limited, which greatly limits the improvement of flower color of Rhododendron, as well as its medicinal and edible value. In this study, Rhododendron delavayi is used as material, and several approaches will be taken to verify the mechanism of flower color formation of Rhododendron delavayi on the following three aspects: ⑴ Qualitative and quantitative analyses of anthocyanin on flower of Rhododendron delavayi; ⑵ screening and cloning of the key 3GT genes that affect flower color formation of Rhododendron delavayi; ⑶ Comprehensive analysis of the biological function of the key 3GT genes. The objective of this project is to elucidate the influence and mechanism of 3GT genes on flower color formation of Rhododendron delavayi. The potential results will provide new insights into the mechanism of flower color formation of Rhododendron. On the other hand, the key 3GT genes acquired in the study will be used for flower color modification directly, and all this implies their theoretical significance and application values in modern agriculture.

花色形成及其调控机理研究是观赏植物次生代谢研究的热点与核心问题，但有关传统名花杜鹃的花色苷代谢研究却在很大程度上落后于百合、菊花等观赏植物，且目前关于杜鹃花色苷代谢与调控机理的研究尚处在起步阶段，相关分子信息非常有限，这极大地限制了研究者对杜鹃的花色改良及其药用和可食用价值的开发利用。本项目以黔产马缨杜鹃为研究材料，综合利用分子生物学、遗传学和生物化学技术从三个方面对类黄酮3-O-糖基转移酶（3GT）调控马缨杜鹃花色形成的机理进行研究：⑴ 马缨杜鹃花朵花色苷的定性与定量分析；⑵ 影响马缨杜娟花色形成的关键3GT基因的筛选与克隆；⑶ 全面系统地解析关键3GT基因的生物学功能。本项目旨在揭示3GT对马缨杜鹃花色形成的影响及调控机理。相关研究一方面可以丰富并补充国内外关于杜鹃花色成色机制研究的空缺，另一方面所获得的有功能的3GT基因可以直接用于植物花色改良，具有重要的科学理论意义和应用价值。

花色是观赏植物非常重要的园艺性状之一，其主要是由花色苷的种类与含量决定。但是现阶段关于传统名花杜鹃的花色苷代谢研究却在很大程度上落后于百合、菊花等观赏植物，这极大地限制了研究者对杜鹃的花色改良及其药用和可食用价值的开发利用。因此，本项目率先对马缨杜鹃花色呈色机制展开研究，主要研究结果如下：花朵中花色苷的定性与定量分析显示，伴随马缨杜鹃开花过程中，花青素3-O-糖苷一直是花朵中含量最多的花色苷，占花朵总花色苷的93.68-96.31%，表明类黄酮 3-O-糖基转移酶（3GT）在马缨杜鹃花色成色过程中作用十分关键。基于转录组测序结果，共筛选合并获得7条Rd3GT基因，同时基因表达与花朵总花色苷含量变化的相关性分析显示，Rd3GT1和Rd3GT6表达同花色苷积累呈显著相关。 随后，通过分子生物学方法成功克隆获得上述两个基因，并分别将其构建到真核与原核表达载体上，拟南芥的遗传转化实验证明上述两个基因确实是类黄酮 3-O-糖基转移酶基因，可以成功恢复拟南芥UGT78D2突变体的花色苷合成。烟草的遗传转化实验显示，上述两个基因不紧可以加深烟草花朵颜色，还使烟草花朵中花色苷的种类由2种增加至5种，表明Rd3GT1和Rd3GT6可作为增加植物花青素种类的分子工具。另一方面体外酶活实验证明，Rd3GT1和Rd3GT6均可以使花青素的3-OH位点发生糖基化，并且Rd3GT6还可以同时糖基化花青素的4’-OH。底物与糖基供体特异性分析显示，矢车菊素和UDP-半乳糖是Rd3GT1与Rd3GT6的最佳花青素底物与糖基供体，同时，Rd3GT6比Rd3GT1具有更广泛的底物与糖基供体选择性，表明在马缨杜鹃花色呈色过程中Rd3GT6在花色苷种类多样性方面发挥了主要作用。本项目成功筛选并克隆验证了两个调控马缨杜鹃花色呈色的关键3GT基因，为杜鹃花色基因工程育种及其天然花色素的开发与应用提供了科学依据与分子工具。