海洋弧菌T3SS的分子多样性及其与毒力的关联分析

Marine Vibrios are the most common bacteria that are widespread in the coastal and estuarine environments, some species of them, however, are recognized as opportunistic pathogens to both marine animals and humans. So many attentions have been paid on virulence differences of marine Vibrios. Type III secretion system (T3SS) is a highly-conserved apparatus among several gram-negative bacteria, which delivers bacterial virulence proteins, called effectors, into host cells and is directly involved in pathogenesis of bacteria. However, the effectors vary significantly from system to system, even within families of T3SS. In this study, we focus on the molecular diversity of T3SS in marine Vibrios and then explore its relevance to virulence of marine Vibrios. To this end, first, we systematically examine the distribution of T3SS in different marine Vibrios using PCR assay, and then determine the genomic sequence in the hypothetical regions encoding effectors of the T3SS using chromosome walking, and ascertain molecular diversity of the effectors of T3SS in different marine Vibrios. Importantly, we respectively construct the null mutants of structural protein and effector protein genes of T3SS using the suicide plasmid pDM4-based gene knockout systems, and then we use these mutants to study effect of molecular diversity on T3SS-induced cell death. Furthermore, using animal challenge models in vitro, we will cast light on molecular diversity of T3SS and its relevance to virulence in marine Vibrios. All data obtained from the study will contribute to illustrate differences in virulence mechanism of different marine Vibrios.

海洋弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，但部分种类是人和海洋动物的重要病原菌，故其毒力差异的机制备受关注。三型分泌系统(T3SS)是许多病原细菌中保守存在的毒力装置，通过分泌效应蛋白直接参与病原菌的致病过程，但不同病原菌之间的效应蛋白存在较大差异。本项目旨在研究不同海洋弧菌之间在T3SS效应蛋白编码上的多样性及其与毒力的关系。拟首先通过PCR技术系统调查T3SS在不同海洋弧菌中的存在情况，然后采用染色体步移技术测定不同海洋弧菌在T3SS效应蛋白编码区的序列，查明海洋弧菌T3SS编码效应蛋白的多样性；进一步利用基于pDM4自杀质粒的基因敲除技术，构建不同海洋弧菌T3SS的效应蛋白基因缺失突变株，并用以重点研究效应蛋白的多样性对其致宿主细胞死亡的影响；并借助实验动物感染模型，最终阐明不同海洋弧菌的T3SS效应蛋白多样性与其毒力的关系；研究结果对于揭示不同海洋弧菌在毒力上的差异机制具有重要意义

弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于世界各地近岸及河口海水、沉积物和海洋生物体内，虽然大多数种类是海水和许多海洋生物的正常或有益菌群的成员，但部分种类却是人和海洋动物的条件病原菌。海洋弧菌种类繁多，具有丰富的遗传多样性，其毒力机制也存在不同。三型分泌系统(T3SS)是许多病原细菌中保守存在的毒力装置，通过分泌效应蛋白直接参与病原菌的致病过程，而T3SS分泌效应蛋白在不同病原细菌中存在差异。本项目首先通过在华南沿海分离或购买获得72株海洋弧菌菌株，利用多位点序列分析（Multilocus sequence analysis, MLSA）技术对其进行鉴定，72株弧菌菌株隶属于23种不同弧菌，并发现T3SS仅存在于溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、坎氏弧菌和塔氏弧菌中；利用长片段PCR扩增和基因组步移等解析了36株不同海洋弧菌株的T3SS效应蛋白区，发现在编码效应蛋白种类和数量方面存在着差异；在此基础上深入研究了溶藻弧菌T3SS致鱼类细胞死亡的分子机制，鉴定出效应蛋白Val1686和Val1680，其中Val1686负责诱导鱼类细胞变圆和凋亡，而Val1680在致鱼类细胞膜通透性方面发挥作用；同时还揭示了溶藻弧菌T3SS基因表达调控机制，鉴定出负调控蛋白ExsE，阐明了Val1686对宿主细胞基因表达谱式的影响；在副溶血弧菌方面本项目聚焦于T3SS2肠毒性机制，鉴定出效应蛋白分子VopI，利用新生兔作为感染模型，揭示VopI有助于副溶血弧菌在肠道内的定值。测定哈氏弧菌E385和坎氏弧菌LMB29基因组序列，分析发现它们T3SS效应蛋白编码区不同于溶藻弧菌和副溶血弧菌，存在一个新的效应蛋白分子Afp17，其具有ADP-ribosylation toxin功能结构域，通过在鱼类细胞水平和河豚鱼作为感染模型，发现哈氏弧菌E385较强毒力，而坎氏弧菌LMB29具有较弱的毒力，尽管它们在T3SS效应蛋白编码区有类似的特点，这说明哈氏弧菌E385存在其它未鉴定的毒力因子参与致病作用。总之，通过本项目研究查清了T3SS 在不同海洋弧菌中的存在情况，揭示了海洋弧菌T3SS效应蛋白编码区的差异，阐明了海洋弧菌的毒力与T3SS密切相关，但是海洋弧菌毒力并不局限于T3SS，在个别菌株中存在其它未鉴定的毒力因子。