Maspin在受精中的作用及机制研究

精子卵子受精环节的缺陷在辅助生殖临床检测中不易发现，造成病人精神和经济上的负担。对精子结合卵子形成受精卵的分子机制进行更深入的研究，能为不明原因不孕症检测提供新的诊断分子，及早为患者选用更合理的方案，同时也有利于以阻断受精为靶点寻找更有效、安全和副作用小的避孕方法。本研究在前期工作中采用基因敲除技术发现maspin与受精过程密切相关。通过免疫共沉淀实验、细胞黏附实验等分子生物学技术已证实maspin与uPA受体uPAR形成复合物并与细胞黏附相关。在本项目研究中，我们拟运用分子生物学和细胞生物学方法，结合体外和在体实验对maspin及uPA/uPAR系统在受精中的作用开展深入的研究，以期阐明它们在受精过程中的作用机制、作用途径和作用位点。

在本研究中我们收集IVF患者的精子标本，根据其受精率①受精率低组；和②受精率正常组。通过精子的免疫荧光分析，对不同组maspin的表达进行检测，发现正常精子maspin在精子核后区（与受精密切相关的部位）表达，而受精率低的精子表达相应缺陷。同时做了western blot，也得出相应的结论。提示maspin与受精的相关性。我们还采用受精率正常组IVF患者的精子标本与不同浓度的maspin的抗体孵育，以仓鼠卵作为模型观察其受精能力的变化。发现maspin抗体明显抑制精子穿入卵细胞，从而确定maspin参与受精。本课题设计合成maspin不同部位的约20个氨基酸的短肽，以细胞和细胞外基质为模型，检测不同肽段对重组maspin促进细胞粘附的竞争性抑制作用，发现190-202以及260-275片段对重组maspin促进细胞粘附有竞争性抑制作用，从而进一步的明确maspin的细胞粘附功能区（参与受精的部位）。分析maspin蛋白细胞粘附功能区的晶体结构，构建了E201K，K268E/K270E，E201K/K268E/K270E和对照D177A/S178L/T180P突变体，发现201、268、270氨基酸对maspin的细胞粘附作用具有显著性作用。从而明确maspin促进细胞粘附（参与受精）的氨基酸。