转抗虫基因杨树多基因互作及高效表达机制研究

This project aims to explore the construction principle of multigene plant expression vector, innovate a new simple, rapid and efficient plant vector construction techniques for multigene expression. Several Bt genes and other insect-resistance genes with clear functions would be constructed to one plant expression vector in different fusion and series ways; Poplar leaf tissues will be genetically transfered to gain different types of transgenic lines via Agrobacterium mediated co-transformation method; By using molecular detection methods, including PCR, real-time fluorescence quantitative PCR, Tail-PCR, ELISA techniques and insect resistance tests, the influence on exogenous gene transcription and translation caused by multigene arrangement mode, the type and function of the promoter, multigene insertion site, the copy number and gene homology will be studied. The interactions between different Bt genes and the high expression mechanism of multigene are to be explored and revealed. High expression transgenic lines also can be selected at the same time, thus laying the foundation for insect-resistance transgenic poplar breeding.

本项目拟探索多基因植物表达载体构建原理，创新简便、快速、高效新型多基因植物表达载体构建技术，将多个功能明确的Bt等抗虫基因以不同融合和串联方式构建在多基因植物表达载上；通过农杆菌介导法一次转化杨树叶片组织，获得不同类型转多基因株系；通过PCR、实时荧光定量PCR、Tail-PCR、酶联免疫等分子检测手段及抗虫性验证，研究多基因排列方式、启动子的种类和作用、多基因插入位置、拷贝数、基因同源性等对外源基因转录和翻译的影响，探索不同Bt基因间的互作关系，揭示多基因高效表达机制，获得高表达转基因株系，为转抗虫基因杨树育种奠定基础。

转基因杨树的商品化应用，展现出了巨大的应用前景，但是和农业转基因研究相比，还存在多基因转化困难、转入基因种类少、基因表达效率低等问题。因此林木多基因的转化、基因互作、高效表达等问题急需要突破。本项目主要研究内容是探索和创新简便、快速、高效多基因植物表达载体构建原理和技术，将两个功能明确的Bt等基因以不同组合方式构建在多基因植物表达载上；通过农杆菌介导法转化杨树和烟草叶片组织，获得不同类型转多基因株系；通过常规PCR、实时荧光定量PCR、酶联免疫技术（ELISA）等分子检测手段及抗虫性验证等，探索转基因植物多基因互作及高效表达机制。经过4年的研究，完成了各项预期指标，取得了预期研究成果：. （1）利用同尾酶原理，创制出了简单、快速、高效的新型的多基因植物表达载体，只需进行酶切、连接、转化等常规步骤即可实现多基因构建，实现了多个抗虫、耐盐基因植物表达载体构建，并转入杨树和烟草中，获得转多基因植株。. （2）明确了多个外源基因排列顺序、排列方向、启动子和增强子结合方式、MAR结构、基因插入位置、基因拷贝数、基因同源性等对外源基因转录和蛋白表达的影响，证明同源Bt基因排列顺序和方向是影响高效表达的关键。. （3）明确了不同抗虫基因在植物基因组 DNA 上的整合、mRNA 转录和毒蛋白翻译上互作关系，证明同源性多Bt基因在转录水平互作不明显，在蛋白质水平互作显著，确定了目的基因高效表达组合类型，揭示了多抗虫基因高效表达机制。. （4）在项目执行期间发表了相关论文15篇，其中SCI收录8篇，EI收录2篇；培养博士研究生1名，硕士研究生8名；获得实用新型专利1件，申报发明专利2件。. 本项目创制出简明高效多基因植物表达载体系统，筛选出多目的基因高效表达组合类型，获得了系列转基因株系，为转多基因杨树育种奠定基础，具有广泛的应用前景。