基于1H-NMR代谢组学和转录组学的花椒种质资源研究

Based on the previous work and comprehensive investigation, the 1H-NMR metabolomics combined with transcriptomics will be used to study the germplasm resources of Zanthoxylum bungeanum according to the key and difficult problems and utilization of Z. bungeanum germplasm resources. The 1H-NMR metabolomics protocol combined with RNA sequencing technology and biological activities evaluation will be used to elucidate the characteristics, variation patterns and heterogeneity of alkylamides and flavonoids in Z. bungeanum germplasm. EST-SSR molecular markers will be used to reveal the genetic diversity and variation patterns of different Z. bungeanum germplasm resources and analysed the relationship between genetic variation and variation of alkylamides and flavonoids.The differences of key control genes expression and molecular basis of the variation of alkylamides and flavonoids will be revealed by comprehensive metabolome and transcriptome analysis with validated by qRT-PCR, and the correlation between the genetic variation and the variation of genes expression will be carried out. The research results are fully intergrated to establish comprehensive evaluation system, which can provide “variety” and “quality” of Z. bungeanum. The genetic diversity of different germplasm resources and their quality will be evaluated comprehensively, genetic relationships between Z. bungeanum germplasm will be detected, classification of variety will be revised and verified, variety composition will be found out, special and excellent germplasm will be screened out. This project provides the theoretical basis for the conservation and utilization of Z. bungeanum germplasm resources, classification and naming , secondary metabolism regulation, directional cultivation and breeding of new varieties.

本项目在已有工作和全面调查、搜集花椒种质资源的基础上，针对花椒研究中的关键和难点问题并结合其应用特性，采用1H-NMR代谢组学和转录组学技术，系统研究不同花椒种质中麻味素和黄酮的组成特征，揭示各种质间差异标识成分并阐明其变异规律；同时结合其生物活性评价，进一步明确各种质的异质性；采用EST-SSR分子标记，阐释不同花椒种质遗传多样性及其变异规律，并剖析遗传变异与黄酮和麻味素变异的关系；综合分析代谢组和转录组数据，结合qRT-PCR验证，明晰花椒麻味素、黄酮合成的关键控制基因，并探讨遗传变异与麻味素、黄酮基因表达变异间的关系；对以上研究结果进行整合分析，建立同时体现“品种”和“质量”的花椒种质资源综合评价体系，明晰各种质间的亲缘关系，澄清花椒品种混乱问题，摸清花椒种质资源的品种构成、筛选出特殊和优良种质，为花椒种质资源保护和利用、分类命名、次生代谢调控、定向培育及新品种选育提供理论依据。

花椒麻味素和黄酮类化合物因其独特的风味和特殊的生理活性，可作为花椒种质资源评价的重要标志性成分。但现行的评价标准具有一定的局限性，很难全面体现花椒的药食同源内在品质，极大地限制了花椒资源的保护和利用。本项目从代谢和分子水平对花椒种质资源进行了研究，主要成果有：（1）分离鉴定了羟基-α-山椒素麻味物质以及槲皮苷等9个单体化合物。在此基础上，根据麻味素酰胺键1H-NMR特征和黄酮6′-H特征，首次建立了1H-NMR定量分析花椒麻味素和黄酮的方法，解决了因麻味素结构不稳定，常规色谱分析麻味素必需标准品的缺陷，为花椒种质资源质量控制与评价提供了新的手段。（2）构建了体现整体性的不同花椒种质1H-NMR指纹图谱，明确了12个区分不同花椒种质的麻味素和黄酮化学特征峰，结合化学计量学分析，对不同花椒种质进行了归类划分与未知种源鉴定模式构建，评价了不同花椒种质的综合得分，发现韩城无刺综合得分较高，品质较好，府谷花椒品质最差。（3）明晰了6条麻味素合成和10条黄酮合成的关键差异基因，对麻味素合成的2条关键基因进行了功能验证，发现不饱和脂肪酸合成与麻味素的合成相关。（4）针对筛选出的差异基因，开发出16对麻味素和黄酮EST-SSR专用引物，从分子水平揭示了不同花椒种质遗传多样性差异，明晰了各种质间的亲缘关系，发现韩城大红袍遗传多样性水平最高，凤县大红袍最低，遗传变异主要出现在种质内部。构建的EST-SSR指纹图谱，可进行不同花椒种质的鉴别。（5）揭示了遗传变异与麻味素、黄酮变异的关系，发现麻味素含量差异受相关表达基因调控更显著。（6）额外开展了花椒化学型形成与其结构发育的相关性研究，确定了花椒精油和酚类物质化学型的划分依据，探明了花椒的形态结构特征、生长发育规律与主要化学成分积累的关系，对本项目原计划研究内容起到有益的补充作用。本研究结果对花椒种质资源保护和利用、麻味素和黄酮代谢调控、特种功效专用花椒的定向培育及新品种选育具有重要的指导作用。