牡蛎胞外超氧化物歧化酶在抵御环境胁迫中的功能及作用机理研究

Defense against environmental stresses represents a survival strategy and a prerequisite for normal growth and development of mollusks. It is believed that superoxide dismutase (SOD) is involved in organisms’ stress defense by playing a role in antioxidant defense via elimination of reactive oxygen species (ROS). Recent findings suggested that the most abundant protein in oyster plasma is possibly encoded by an extracellular superoxide dismutase (Ec-SOD) gene. However, it does not have SOD activity, but is possibly involved in metal binding and transportation independently or through forming multiprotein complex with other plasma proteins. To test the hypothesis, we plan to carry out the following studies in the proposed project: (1) structure and transcription regulations of Ec-SOD genes in the Pacific oyster, Crassostrea gigas, and the sequence based functional prediction; (2) comparison between intracellular and extracellular compartments in SOD activity and molecular composition; (3) measurement of in vitro metal binding capacity of the plasma Ec-SOD like protein, multiprotein complex and protein particles; (4) mechanisms for the formation of the metal carrying multiprotein complex in oyster hemocytes; and (5) Ec-SOD responses in oysters challenged with physiochemical and biological stressors. The accomplishment of the project likely leads to the finding of SOD new functions and novel metal metabolism mechanisms. It could also generate valuable information for understanding molluscan anti-stress mechanisms and related selective breeding programs.

抵御环境胁迫是贝类生存和生长发育的前提。超氧化物歧化酶 (SOD)通过清除活性氧在抵御环境胁迫中发挥作用。但近期研究提示一种可能由牡蛎胞外超氧化物歧化酶（Ec-SOD）基因编码的蛋白单独或与别的蛋白构成多蛋白复合体结合转运金属离子。而太平洋牡蛎基因组包含6个Ec-SOD基因。它们可能编码不同功能蛋白，使Ec-SOD通过抗氧化和金属结合双重作用参与牡蛎抵御环境胁迫。为验证这一假设，本项目拟开展：（1）太平洋牡蛎各Ec-SOD基因结构、调控和序列基础上的功能预测；（2）细胞内外SOD活性和分子构成比较；（3）血浆内Ec-SOD样蛋白、多蛋白复合体和蛋白颗粒体外结合金属离子能力测定；（4）结合金属离子的多蛋白复合体形成原理；（5）牡蛎在理化和生物胁迫作用下Ec-SOD的反应。本项目总体目标是探索SOD新功能和新的动物金属调节机理，研究结果将对认识贝类抗逆机制、指导抗逆选育等提供依据。

胞外型铜锌超氧化物歧化酶（Ec-SOD）被认为通过清除细胞外活性氧在生物抗氧化胁迫中发挥重要作用。但牡蛎Ec-SOD被发现没有SOD酶活性，却似乎有金属结合能力。在本项目实施过程中，我们从太平洋牡蛎基因组内鉴定到６个Ec-SOD同源基因，其中３个与美洲牡蛎的相同，有十分密切的同源关系，另外2个基因大小差异明显，而还有一个与美洲牡蛎segon同源，但分子中融合了部分dominin结构域。天然存在的和重组表达的蛋白质均无SOD活性，但对Cu和Zn有强结合能力。它们可能构成一种蛋白颗粒载体参与牡蛎体内金属离子的储运。另外，研究发现，牡蛎有胞质型CuZnSOD。而其它一些包含CuZnSOD结构域的细胞外分子，在大小和分子特性上差异巨大，其中包括一种只含CuSOD结构域重复蛋白（CSRPs），这些特性差异巨大的蛋白质分子预测有发出SOD酶活性的潜力和结构基础，其显著的分子多样性，暗示它们代表一个进化活跃的基因/蛋白质家族，而且它们对于宿主有明显的功能意义。鉴于它们与SOD之间的同源性，它们通过某种独特机理参与宿主抗氧化乃至抗逆反应机制是可能的。因此，本项目的相关结果为贝类抗逆机制研究开辟了一个新的视角。另一方面，本项目还研究了贝类独有的一个蛋白酶抑制因子家族——I84。研究结果显示，该家族分子只分布在软体动物门物种，有明显谱系特异性基因扩张。由于多方面的报道已经推测该家族蛋白酶抑制因子极有可能参与宿主抗病原和抗逆境反应，所以I84家族或许代表一种贝类独有的免疫效应机制。而本项目中所获得的相关一些重要发现，为今后研究该蛋白质/基因家族的生物学功能奠定了重要基础。