基于AMPK介导的自噬调控肿瘤相关巨噬细胞极化探讨消水方治疗恶性胸腔积液的作用机制

Inhibiting the polarization of M2 phenotype tumor-associated macrophage (TAM) is an important therapeutic mechanism for malignant pleural effusion (MPE), and macrophage autophagy induced by AMPK could regulate the polarization of macrophage. Xiaoshui decoction could reduce MPE which have been demonstrated by our previous clinical and experimental studies, but there is little inhibition effect of Xiaoshui decoction on tumor proliferation, indicating that some other mechanism exists. The pre-expriment showed that Xiaoshui Decoction could decrease the expression of M2 phenotype macrophages in MPE of mice. So we presume that Xiaoshui decoction could reduce MPE by regulating autophagy to control the polarization and function of macrophage. By establishing C57BL/6 mice lung cancer MPE model and macrophage phenotypic polarization model induced by autophagy, we will employ methods including transmission electron microscope, flow cytometry, western blot, RT-PCR et al to evaluate the effect of Xiaoshui decoction on AMPK-induced autophagy and polarization of macrophages in vivo and in vitro. This study will reveal new mechanism of Xiaoshui decoction treating MPE and provide the novel method for MPE.

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）向M2表型极化是恶性胸腔积液(MPE)形成的重要机制,其中AMPK介导的TAM自噬是促进其向M2表型极化的关键信号通路。前期临床和实验研究显示：消水方具有抑制肺癌MPE的作用，但在抑制胸膜转移瘤体增殖方面作用较弱，提示消水方减少MPE还可能存在其他机制，而预实验表明消水方可以减少小鼠MPE中M2型TAM的表达。基于此我们提出消水方可能是通过干预AMPK介导的巨噬细胞自噬，调控其表型和功能，进而抑制MPE的产生。本课题拟在此基础上，建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型和巨噬细胞自噬促表型极化模型，采用透射电镜、流式细胞术、Western blot、RT-PCR等技术，从体内和体外两方面观察消水方对MPE中AMPK介导的TAM自噬及表型极化的影响，进一步揭示消水方治疗MPE的相关机制，为MPE的临床治疗提供新思路。

背景：中药消水方具有健脾利水，扶正抗癌的功效。前期临床研究发现中药消水方联合胸腔内灌注顺铂可以治疗恶性胸腔积液，但其具体机制尚不明了。内容：1.观察消水方对模型小鼠体重、胸腔积液、胸壁转移瘤、胸腔肿瘤负荷以及生存期的影响；2.观察消水方对小鼠胸膜通透性及肿瘤血管新生的作用；3.观察消水方对巨噬细胞表型的调控作用；4.观察消水方对巨噬细胞自噬的调控作用；5.验证消水方调控巨噬细胞表型与自噬的关系；6.观察消水方对M1型和M2型巨噬细胞的调控作用；7.观察消水方对肿瘤相关巨噬细胞相关信号通路的影响。结果：1.消水方组小鼠MPE体积减少；胸壁转移瘤无显著差异；消水方组小鼠生存期延长。2.消水方组胸水外周血依文思蓝浓度比值、胸水VEGF表达、胸膜肿瘤CD31及CD34表达降低。3.消水方组巨噬细胞CD206表达降低，CD16/32表达增高；消水方组IL-10表达降低，IL-12表达增高，TNF-α表达降低。 4.消水方组p62蛋白表达降低， LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高；MDC免疫荧光值较对照组增强；5.消水方+雷帕霉素组巨噬细胞CD16/32表达增加，CD206表达降低；而消水方+3-MA组巨噬细胞CD16/32表达降低，CD206表达增加；消水方+雷帕霉素组IL-10表达更低， IL-12则无明显差异；消水方+3MA组IL-10表达升高，IL-12表达降低；6.M1型巨噬细胞中，消水方组与对照组p62蛋白、LC3蛋白表达及MDC荧光值无明显统计学意义，M2型巨噬细胞中，消水方组p62蛋白表达降低，LC3- LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高，MDC免疫荧光值较对照组增强。7.消水方组肿瘤相关巨噬细胞p-AMPK、p-ULK1（Ser555）表达升高， p-AKT、p-mTOR及p-ULK1（Ser757）的表达降低，AMPK、ULK1、mTOR及AKT表达无明显差异。结论：1.消水方可以抑制小鼠MPE生成，改善小鼠体重，延长小鼠生存期，但对胸腔肿瘤作用有限；其抑制MPE生成可能与降低胸膜通透性、抑制血管生成有关；2.消水方可以通过上调TAMs自噬水平调控其表型极化，促使MPE中M2型TAMs向M1型转化；3.消水方促进自噬调控TAMs表型的作用可能与调控AMPK/mTOR/ULK1及PI3K/AKT/mTOR通路有关。