基于RNAi和组学技术的昆虫Treh基因功能及控害机理研究

The expression and enzyme activity of trehalase, essential for insect energy metabolism, which is the first key enzyme in chitin synthesis pathway, directly influence the normal development, molting, metamorphosis and reproduction. So the research of trehalase function and its role as pest control target is of considerable theoretical significance and practical value. In this project, Tribolium castaneum and brown planthopper as object, RNA interference and excessive trehalose injection are employed to prepare the Treh down-regulated and Treh up-regulated samples for Digital Gene Expression (DGE)tag profiling and Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ) technology to screen all pathways controlled by Treh. Then brown planthopper are used to confirm the above selected results and Tribolium castaneum and brown planthopper will be used to identify the core pathway regulated by Treh to clearly define the Treh regulatory functions of chitin synthesis, energy metabolism as well as other key pathways and evaluate the security to non-targeted insects.In addition to clarifying the function and pest control mechanism of Treh gene, the project can assess the potential of Treh gene as target for pest control.

海藻糖酶作为昆虫能量代谢和体内几丁质合成途径的关键酶，其基因表达情况和酶活性能否正常发挥直接关系到昆虫能否正常发育、蜕皮、变态和繁殖等。因此，Treh基因的功能及作为害虫控制靶标的研究具有重要的理论意义和应用价值。本项目拟以水稻害虫褐飞虱和赤拟谷盗为研究对象，采用RNAi技术和注射过量海藻糖分别制备Treh基因表达的下调和上调样品，利用高通量转录组测序结合数字表达谱（DGE）及同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术分析筛选获得Treh基因调控下游的所有网络通路，然后利用褐飞虱验证上述筛选结果，并在褐飞虱和赤拟谷盗活体中鉴定Treh基因调控的核心网络通路，最后明确Treh基因对几丁质合成通路、能量代谢通路和其它关键网络通路的调控功能，评价Treh对其它非靶标昆虫的安全性。该项目不仅可在理论上阐明Treh基因的功能，明确Treh基因的控害机理，而且可评估Treh基因作为害虫控制靶标的潜力。

海藻糖酶基因为几丁质合成通路的第一个基因，该基因在昆虫发育、变态等过程中具有重要的作用。首先，本研究分别从褐飞虱和赤拟谷盗中克隆并获得了多个不同溶性海藻糖酶（TRE1或Treh1）和1个膜结合型海藻糖酶（TRE2或Treh2）。采用注射法RNAi技术抑制TRE基因的表达，直接导致昆虫的几丁质合成障碍，包括蜕皮障碍和翅膀畸形等。其次，通过制备褐飞虱3个TRE基因上调和下调样品，采用数字表达谱（DGE）及同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术进行测序和分析，研究结果发现海藻糖酶不但能够调控几丁质合成通路、几丁质降解途径，还能够调控糖原代谢等网络通路等。并且3个TRE基因调控的差异表达基因和差异表达蛋白数量和种类都不同，但是它们都能够调控下游的几丁质合成与几丁质降解通路，具体表现在不同的TRE低表达后，几丁质合成通路相关基因和几丁质酶等表达显著或者极显著下降。再次，通过注射过量的海藻糖、过量的葡萄糖、注射不同的dsTREs及注射不同浓度的海藻糖酶抑制剂等，来上调和下调褐飞虱体内的海藻酶基因的表达。检测几丁质合成通路、几丁质降解途径、海藻糖代谢和糖原代谢等途径相关基因的表达结果发现：海藻糖酶主要通过影响海藻糖含量的平衡从而调控表皮和翅基等组织几丁质代谢途径基因表达变化，导致几丁质含量减低，无法正常完成蜕皮和翅膀发育等过程，并出现高达30%的死亡率，表明TRE基因具有作为害虫控制靶标的潜力。最后，本研究选取褐飞虱的天敌─异色瓢虫来作为非靶标昆虫安全性评价的对象；以dsGFP注射为对照组，注射dsTRE和海藻糖酶以直接Validamycin为处理组，异色瓢虫在24 h取食处理的褐飞虱数量无显著差异；但是除异色瓢虫TRE1-5外，其他TRE基因的表达都极显著下降。这些结果表明TRE作为害虫控制的靶标基因，可能对非靶标昆虫具有潜在安全性问题。该项目不仅从理论上阐明了TRE作为潜在害虫靶标的控害分子机理，而且还研究评估TRE 基因在害虫控制中对非靶标昆虫的安全性。