肿瘤相关免疫细胞在卵巢癌发生发展和免疫治疗中的作用机制研究

为了探讨肿瘤相关免疫细胞在卵巢癌发生发展和免疫治疗中的作用机制，本课题拟用Cre/LoxP定位腺病毒感染技术，制作新型卵巢癌小鼠模型；分离树突状细胞，通过流式细胞仪检测CD80、CD86、CD40等表面分子标记物，与T细胞联合培养ELISA检测IFNγ，了解其抗原递呈功能变化；分离巨噬细胞，用ELISA、定时定量PCR检测IL-10等，了解癌灶免疫微环境变化；分离RNA，用Microarray和Exome测序，寻找特异性基因；双向凝胶电泳分离蛋白质，检测蛋白磷酸化，找出特异性蛋白质；用Western blot和SuperArray研究MAPKs对IL-10等的影响；体内实验用MAPKs等激酶抑制剂，观察宿主免疫和肿瘤生长情况。本研究阐明了MAPKs等传导通路在卵巢癌发生发展中的作用机制，干预这些通路可调控IL-10，改变免疫微环境，逆转肿瘤所致的免疫耐受，为研制卵巢癌免疫疗法提供了新思路。

本课题应用重组酶Cre /loxP定位、腺病毒感染技术，成功建立了卵巢癌小鼠模型来研究肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在调节肿瘤免疫微环境中的作用。应用流式细胞仪从已建瘤的小鼠体内分离出TAM，证明在卵巢癌的免疫微环境中巨噬细胞为M2表型，体外刺激产生大量IL-10和少量IL-12。TAM与树突状细胞的抗原递呈功能均降低，都产生了一定程度的免疫耐受。应用TLR9激动剂CpG可以使巨噬细胞和树突状细胞的抗原递呈功能增强，并通过下调IL-10和上调IL-12使已产生免疫耐受的TAM由M2向M1表型转化。体外实验证明通过使用U0126抑制MAPK/ERK信号通路可使IL-10表达减少，IL-12表达增多。向已建瘤的小鼠腹腔内分别注射PBS、CpG、CpG+U0126，发现腹腔接种CpG和ERK抑制剂组小鼠的生存期明显延长，肿瘤体积明显缩小；ELISA检测该组TAM产生的IL-10较对照组和CpG组均明显减少，而IL-12增多，有效的将TAM从M2型逆转为M1型。我们还发现腹腔接种CpG和ERK抑制剂组小鼠的TAM通过NF-κB经典激活途径，上调iNOS，分泌NO杀死肿瘤细胞；同时该组小鼠还能有效激活Th1细胞，分泌IFN-γ杀伤肿瘤细胞。本研究通过抑制MAPK/ERK通路、调控IL-10和IL-12、免疫调节TAM的表型，使其由促肿瘤活性的M2型转变为杀肿瘤活性的M1型，成功诱导机体产生特异性抗肿瘤应答，为研制卵巢癌免疫疗法提供了新思路。